Средство для подавления вируса герпеса в культуре клеток

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕРПЕСА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК(71) Заявители Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Вотяков Вениамин Иосифович Капич Александр Николаевич Квачева Зинаида Болеславовна Гвоздкова Татьяна Семеновна Николаева Светлана Николаевна Титов Леонид Петрович Лобанок Елена Станиславовна Леонтьев Юрий Михайлович(73) Патентообладатели Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Применение экстракта мицелия гриба, содержащего кетокаротиноиды, в качестве средства для подавления размножения вируса герпеса в культуре клеток. Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии, и может быть использовано для подавления размножения вируса герпеса, в частности вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1) и его вариантов, резистентных к ацикловиру (АЦ. рез. вариант) и фосфоноуксусной кислоте (ФК. рез. вариант). Известны наиболее эффективные и чаще применяемые противогерпетические химиопрепараты 9-(2-гидроксиэктоксиметил)гуанин-ацикловир (АЦ) 1 и фосфоноуксусная кислота (ФК) 2. Недостатком известных препаратов является то, что к ним быстро формируется резистентность. Проблема особенно актуальна из-за частого выделения АЦ.рез. вариантов от больных СПИДом. Известно также средство против вируса герпеса - полидисульфид галловой кислоты(ПГК), обладающий способностью эффективно тормозить размножение вариантов вирусов простого герпеса, резистентных к ацикловиру и фосфоноуксусной кислоте 3. Недос 9985 1 2007.12.30 татками этого средства являются его невысокая эффективность, токсичность, что ограничивает возможности для его практического применения в медицине. Задачей настоящего изобретения является поиск нового средства природного происхождения, обладающего низкой токсичностью, доступностью сырья для его получения,повышенной эффективностью противовирусного действия против вариантов вируса простого герпеса первого типа, устойчивых к известным противовирусным средствам - ацикловиру и фосфоноуксусной кислоте. Задача решается применением экстракта мицелия гриба . , содержащего кетокаротиноиды, в качестве средства для подавления размножения вируса герпеса в культуре клеток. Грибявляется широко распространенным дереворазрушающим грибом, который растет и образует плодовые тела преимущественно на лиственных породах деревьев. Мицелиальные культуры данного гриба легко выделяются в чистую культуру из плодовых тел гриба, после чего мицелий можно выращивать в глубинной культуре на разнообразных питательных средах. Ранее было установлено, что при росте в глубинной культуренакапливает в мицелии кетокаротиноиды 4, а спиртовые экстракты мицелия данного гриба обладают радиозащитным действием 5. Нами установлено новое, ранее неизвестное свойство экстрактов мицелия дереворазрушающего базидиального гриба, заключающееся в том, что они проявляют антивирусную активность в отношении вариантов вируса простого герпеса первого типа, устойчивых к ингибиторам, обладающим высокой избирательностью антивирусного эффекта - ацикловиру и фосфоноуксусной кислоте. О противовирусной активности кетокаротиноидов ранее не сообщалось. Предлагаемое средство получают следующим образом выбирают крупные плодовые тела гриба и выделяют из них мицелиальную культуру гриба. Далее мицелий выращивают на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, серы, калия и витаминов. Выращенный мицелий собирают фильтрованием и замораживают в жидком азоте. Для получения спиртового экстракта 10 г замороженного мицелия гриба вносят в колбу Эрленмейера, заливают 200 мл этилового спирта, помещают на качалку и производят экстракцию в течение 30 мин. Полученный экстракт отделяют от мицелия на стеклянном фильтре, определяют содержание сухих веществ (СВ) в экстракте, разводят дистиллированной водой и определяют максимально переносимую дозу (МПД) препарата для клеток, которая составляет 0,2 мг СВ/мл. После чего исследуют противовирусную активность препарата. Пример. Монослой клеток перевиваемой линииили С 6 инфицируют разными вариантами ВПГ-1 (устойчивыми и резистентными к химиопрепаратам), инкубируют, отмывают от вируса, затем вносят заявляемый препарат - экстракт мицелия гриба в питательной для клеток среде, инкубируют, определяют уровень накопления вируса. В качестве контроля титра вируса используют культуры, к которым не добавляют препарат. Спустя 48-72 ч инкубации культур в термостате (37 С), когда проявление цитопатогенного действия вируса в контрольных культурах максимально, все пробы культур подвергают титрованию с целью вычисления инфекционного титра. Для этого в монослойные культурывносят по 0,1 мл десятикратных разведений исследуемого на инфекционность материала. После 1 ч контакта с клетками жидкость из флаконов удаляют и вносят свежую порцию культуральной жидкости. Через 48-72 ч инкубации в термостате оценивают специфическое цитопатическое действие вариантов вируса, которое выражают в тканевых цитопатических дозах - ТЦД 50/мм, подсчитывают количество бляшек (места просветления на монослое клеток, вызванные репродукцией вируса). Сравнительные уровни противовирусной активности с использованим заявляемого препарата - экстракта мицелия культуры гриба , полидисульфида галловой кислоты,ацикловира, фосфоноуксусной кислоты, в отношении 3-х вариантов ВПГ-1 (чувствительных и резистентных к АЦ и ФК) отражены в таблице. 2 9985 1 2007.12.30 Подавление размножения вариантов ВПГ-1 в культуре клеток С 6 под влиянием препаратов экстракта мицелия культуры гриба , АЦ, ФК, ПГК Варианты вируса простого герпеса 1 Устойчивый к АЦ и ФК АЦ рез. ФК рез. Конц.,Препарат РазРазРазмкг/мл Титр Титр Титр ность с ХТИх ность с ХТИ ность с ХТИ ЦД 50/мм ЦД 50/мм ЦД 50/мм контр. контр. контр. АЦ 2,0 6,4 0 2,0 4,0 100 0,2 3,8 100 ФК 2,0 2,0 5,8 4,0 12 4,2 12 0 0 5,0 4,8 5,1 4.2 ПГК 1,2 10 1,1 4 1,1 10 10,0 4,4 4,6 2.8 1,6 5 1.6 5 3,0 5 2,5 5,5 0,5 0 5,8 0,4 5,2 0 Примечание ХТИ - химиотерапевтический индекс представляет собой отношение между максимальной переносимой концентрацией препарата и его минимально активной вирусингибирующей концентрацией. Как видно из данных, представленных в таблице, препарат грибаингибирует репродукцию всех 3-х вариантов ВПГ-1 - чувствительных и резистентных к АЦ и ФК, и его уровень антивирусной активности достоверно выше, чем у препарата ПГК (Р 0,05). Так, для препарата грибав наиболее эффективной дозе - 5 мкг/мл, подавление титра вариантов ВПГ-1 составляет от 3,0 до 4,2 ТЦД 50/мм, в то время как для препарата ПГК от 1,9 до 3,2 ТЦД 50/мм. ХТИ исследуемого препарата в 4 раза больше, чем у прототипа,что позволяет его отнести к высокоактивным препаратам. Использование мицелия данного гриба позволит расширить сырьевую базу для производства средств, обладающих противовирусным действием. Источники информации 1. Генерализованная герпетическая инфекция факты и концепция / Под общей редакцией акад. РАМН В.И. Вотякова, канд. мед. наук А.Г. Коломийца Мн. Наука и техника,1992. - С. 220. 2. Николаева С.Н., Павлова Н.И., Бореко Е.И. Штаммы вирусов, обладающие лекарственной устойчивостью. В сб. Современные проблемы инфекционной патологии человека(эпидемиология, клиника, микробиология, вирусология и иммунология) Мн., 1998, С. 581. 3. Патент РБ 6352, МПК А 61 К 31/795, С 08 75/14, А 61 Р 31/22, 2004. 4. Патент РБ 4914, МПК С 12 Р 23/00, 1/2, 2003. 5. Конопля Е.Ф., Капич А.Н., Верещако Г.Г. и др. Оценка радиозащитных свойств липокаратиноидного экстракта из мицелия базидиального гриба в условиях внешнего облучения // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1999. - Т. 39. -2-3. - С. 277-281. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3