Средство для подавления вируса иммунодефицита человека в культуре клеток

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Рытик Петр Григорьевич Полозов Генрих Иванович Кучеров Игорь Иванович Сорокин Виктор Леонидович Мистрюкова Любовь Олеговна Подольская Ирина Александровна Мельнова Наталья Ивановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь где 1-3,в качестве препарата, подавляющего репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре Т-лимфобластоидных клеток. Изобретение относится к сульфидам о-аминобензойной кислоты формулы 141224 (где 1-3) - новым биологически активным соединениям, обладающим анти-ВИЧ активностью, которые могут найти применение в медицине, в частности в терапии ВИЧ-инфекции/СПИДа. Структурная формула соединений 1-3 Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вызывает тяжелое инфекционное заболевание, названное СПИД, летальность при котором достигает 100 . Численность ВИЧинфицированных во всем мире составляет около 40 млн. человек и постоянно возрастает. В основе применяемой в настоящее время высокоактивной антиретровирусной терапии ВИЧ/СПИДа лежит использование этиотропных ингибиторов ВИЧ 1. Несмотря на очевидные ощутимые успехи в борьбе с инфекцией, в последние годы все больше обращают на себя внимание недостатки . Основными из них являются ее высокая стоимость (до 12000 долларов США в год на одного пациента при применении стандартной 3-компонентной терапии), наличие практически у всех используемых антивирусных препаратов выраженных побочных эффектов и существенное снижение с течением времени эффективности лечения за счет формирования у вируса резистентности к применяемым терапевтическим средствам 2, 3. По этой причине представляется оправданным и целесообразным поиск новых антиретровирусных (АРВ) соединений, лишенных указанных недостатков 4, 5, 6. Известно, что некоторые представители класса полисульфидов являются сильными антиоксидантами 7. Это свойство привлекает к ним особое внимание фармакологов, т.к. такого рода препараты, как правило, не лишены и противовирусной активности. Задача изобретения - поиск среди представителей класса полисульфидов коммерчески доступных, малотоксичных, обладающих выраженной анти-ВИЧ активностью соединений. Результат достигается применением сульфидов о-аминобензойной кислоты формулыв качестве препарата, подавляющего репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре Т-лимфобластоидных клеток. Указанное соединение получают реакцией о-аминобензойной кислоты с монохлористой серой в растворе ацетонитрила при охлаждении в присутствии каталитического количества железа 1-3 Новизна изобретения заключается в обнаружении у данного соединения способности тормозить репликацию ВИЧ в инфицированных клетках. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. К раствору 2,74 г (20 ммоль) о-аминобензойной кислоты в 30 мл сухого ацетонитрила при -15 С и интенсивном перемешивании добавляли 50 мг порошкообразного железа и 2 12529 1 2009.10.30 далее по каплям раствор 1,35 г (10 ммоль) свежеперегнанной монохлористой серы. Реакционную смесь выдерживали 2 ч при -15 - -10 С и затем 1 ч при комнатной температуре,выливали на лед. Образовавшийся осадок фильтровали, промывали на фильтре водой(330 мл), затем толуолом (310 мл) и сушили в вакууме. Получили 3,0 г продуктав виде желто-зеленого порошка. Т. пл. 160-170 С (с разложением). НайденоС 42,92 Н 3,057,0426,65. М.м. 368,45. Для продукта(3) С 14 Н 12243 вычисленоС 45,63 Н 3,287,6026,11. Данные ВЭЖХ образцауказывают на значительное преобладание (64 ) в смеси трисульфида (3). В масс-спектреимеются пики молекулярных ионов три-, ди- и моносульфидов (соответственно / 368, 336 и 304). Пример 2. Определение максимально переносимой концентрации (МПК) соединения на Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4. Клеточную суспензию в концентрации 400105 клеток/мл в объеме 200 мкл вносили в лунки 96-луночной панели. Питательная среда -1640 содержала 10 сыворотки эмбрионов коров, 0,03-глютамина, 10, 50 мкг/мл гентамицина сульфата и 8 мкг/мл тилозина тартрата. Титрование соединения (исходная концентрация 5,0 мг/мл в 96 -м этаноле) проводили с 5-кратным шагом параллельно с эталонным АРВ препаратом азидотимидином (З). Панели инкубировались в атмосфере, содержащей 52 при 37 в течение 4 суток. Учет результатов путем определения жизнеспособности клеток при окрашивании витальным красителем трипановым синим проводили с помощью светового микроскопа. В результате испытаний установлено, что максимально переносимая концентрация для клеток МТ-4 соединениясоставила 45,0 мкг/мл, в то время как для АЗТ этот показатель был равен 5,5 мкг/мл. Пример 3. Определение анти-ВИЧ активности соединения методом формазанового теста (ФТ). Эксперименты проводились на Т-лимфобластоидных клеточных линиях человека. и МТ-4. Инфекционным агентом служил высокорепликативный (/) штамм ВИЧ-1 8 с инфекционным титром не менее 6,0 ТЦД 50. Испытания проводили по терапевтической схеме, предусматривающей последовательное внесение в лунки с клетками препарата и вируса. Исходный раствор препарата (5,0 мг/мл) готовилина 96 -м этаноле, титровали в лунках 96-луночной панели с 5-кратным шагом, после чего в лунки вносили клетки и вирус. Контролями служили необработанные препаратом ВИЧ-инфицированные клетки (контроль вируса) и необработанные препаратом неинфицированные клетки (контроль клеток). Панели инкубировались в атмосфере,содержащей 5 СО 2 при 37 в течение 4 суток. Титрование исследуемого образца соединения проводили параллельно с АЗТ. Методика базируется на определении содержания формазанового продукта, который формируется за счет митохондрий живых клеток после внесения в культуру реагента МТТ(3-(4,5-диметил-тиазол-2)-2,5-дифенал-тетразолиум-бромида). После растворения с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) образовавшегося в лунках формазанового продукта интенсивность развившегося окрашивания измерялась на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Результаты теста учитывали путем определения индекса защиты (ИЗ) клеток. Показатель ИЗ выше 50 свидетельствовал о наличии анти-ВИЧ активности у испытуемого соединения. В положительных случаях определяли 50 -ную эффективную концентрацию (50 -) препарата и химиотерапевтический индекс(ХТИ) - соотношение МПК/ЕС 50, характеризующее широту спектра его нетоксических эффективных концентраций. Показатель соотношения МПК/50 менее 2,0 указывал на 3 12529 1 2009.10.30 низкую, 2,1-7,9 - на среднюю и более 8,0 - на высокую антивирусную активность препаратов 9. В результате испытаний установлено, что ВИЧ-ингибирующая активность соединения в зависимости от условий проведения экспериментов проявлялась в диапазоне концентраций от 40,0 до 0,32 мкг/мл, при среднем показателе ЕС 50 13,56 мкг/мл, ХТИ - 3,32. Пример 4. Оценка анти-ВИЧ активности соединения методикой прижизненной окраски клеток индикатором трипановым синим (ОТС). Испытания проводились на Т-лимфобластоидной клеточной линии МТ-4 в аналогичных с ФТ условиях. Результаты теста учитывались на 4-е сутки с помощью прижизненной окраски клеток 0,2 раствором трипанового синего ( ). Методика позволяет непосредственно судить о количестве живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток, подсчитываемых в камере Горяева под световым микроскопом Ломо АУ-12 (ув. 1,5720). Об эффективности препарата судили по величине ЕС 50, при которой количество живых клеток, обработанных препаратом и инфицированных ВИЧ, на 50 превышало их число в контроле вируса, и соотношению МПК/ЕС 50. В результате установлено, что испытуемый препарат защищал клетки от цитопатического действия ВИЧ-1. Анти-ВИЧ активность соединения в зависимости от условий проведения экспериментов регистрировалась в диапазоне концентраций от 35,0 до 1,4 мкг/мл. Показатель ЕС 50 составил 10,9 мкг/мл, ХТИ 4,13. Пример 5. Подавление соединениемрепликации ВИЧ в инфицированных клетках регистрируемой реакцией непрямой иммунофлуоресценции (НИФ). Испытания проводили на Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4. Условия проведения экспериментов были аналогичны вышеописанным. Учет результатов проводили через 72 ч после начала эксперимента путем фиксации клеток и последующей их последовательной обработкой поликлональной ВИЧ-позитивной сывороткой, а затем меченным ФИТЦ конъюгатом (кроличья сыворотка против иммуноглобулиновчеловека) с добавлением красителя - для устранения неспецифического свечения. Полученные препараты просматривали в УФ-диапазоне под люминесцентным микроскопом с использованием масляной иммерсии (МИ 901,25). Об эффективности соединения судили по величине 50 - концентрациях, на 50 снижающих число специфически светящихся (т.е. инфицированных) клеток по сравнению с контролем вируса (инфицированных,но не обработанных препаратом клеток). Этот показатель определяли путем подсчета 200 клеток каждого образца, включая все контроли. В результате экспериментов установлено, что в диапазоне концентраций 35,00,8 мкг/мл испытуемое соединение подавляло репродукцию вирусных антигенов. Показатель составил 13,7 мкг/мл, ХТИ 3,28. Суммарные данные оценки различными методами ингибирующего действия полидисульфида о-аминобензойной кислоты на ВИЧ приведены в табл. 1. Таблица 1 Результаты испытаний соединенияна анти-ВИЧ активность различными методами Методы испытаний Показатели ФТ ОТС НИФ Диапазон активных концен 40,0-0,32 35,0-1,4 35,0-0,8 траций (мкг/мл) 50 (мкг/мл) 13,56 10,90 13,72 МПК/ЕС 50 3,32 4,13 3,28 12529 1 2009.10.30 Пример 6. Определение токсической дозы соединения . Методические приемы испытаний осуществлялись в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств(Москва, 2005 г.). Опыты проводились на беспородных мышах-самках, содержащихся на обычном пищевом режиме и стандартизованных по массе тела (18-20 г). Минимальное количество животных в опытных группах составляло 6 (ориентировочное определение стартовой дозы) и 12 особей (титрование токсической дозы). Навески субстанций растворяли в 0,9 растворе(5 мг препарата на 150 мкл растворителя). Готовые растворы вводились с помощью зонда внутрижелудочно в объеме 0,5 мл. Наблюдение за животными велось в течение 2 недель. По истечении срока наблюдения определяли среднелетальную (острая 50 при однократном внутрижелудочном введении) дозу соединения . Расчет 50 осуществляли по формуле, где А - начальная токсическая доза (мг/кг)- интервал между дозами (мг/кг) а - смертность при начальной токсической дозе- смертность при последующей токсической дозе. Установлено, что доза препарата 1250 мг/кг явилась абсолютно токсичной для животных все опытные особи погибли в течениенедели эксперимента. Доза 250 мг/кг оказалась безвредной (по истечении 2 недель все опытные животные были живы). Результаты последующего титрования токсичности соединенияпредставлены в табл. 2. Таблица 2 Результаты определения токсичности соединенияна беспородных мышах Испытуемые Кол-во животных Из них Накопление частоты Показатель дозы (мг/кг) в опыте погибли Погибли Выжили смертности 250,0 12 0 0 40 0 500,0 12 0 0 28 0 750,0 12 2 2 16 11,1 1000,0 12 6 8 6 57,1 1250,0 12 12 20 0 100,0 Проведенными исследованиями установлено, что показатель 50 соединениясоставил 961,4 мг/кг. 57,111,1 В соответствии с методом классификации токсичности 10 установленную дозу 961,4 мг/кг - следует отнести кразряду, что соответствует определению умеренная токсичность. Таким образом, установлено, что сульфиды о-аминобензойной кислоты формулыявляются среднеактивными в отношении ВИЧ соединениями, способными подавлять активность ВИЧ. Как видно из примеров 3-5 (таблица), испытанный образец защищает более 50 чувствительных клеток от цитопатического и цитолитического действия ВИЧ 1 и препятствует репродукции вирусных антигенов инфицированными клетками. Полученные результаты позволяют рассматривать данное соединение в качестве препарата,обладающего анти-ВИЧ свойствами и умеренно выраженной токсичностью. 12529 1 2009.10.30 Источники информации 1..,.//.3, 2002. - . 3. 2.,. - -//. - 2003. - . 9(18). .1419-1431. 3. Папуашвили М.Н. Подходы к терапии ВИЧ-инфекции // ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. - 2001. - Т. 5. -2. - С. 92. 4. Патент 7675, МПК 61 33/26,12 7/04, А 61 Р 31/18, 2006. 5. Патент 7678, МПК 61 31/455, 31/52,12 7/04, А 61 Р 31/18, 2006. 6. Акимов Д.В., Филимонов Д.А., Коростков В.В. Ингибиторы протеазы - возможное будущее ВИЧ/СПИД терапии // Хим.-фарм. журнал. - 2002. - Т. 36. -11. - С. 3-7. 7. Патент 3164, МПК 07 323/63,08 75/14, А 61 К 31/195, 31/795, 1999. 8. Рытик П.Г., Ван-дер-Гроен Г., Еремин В.Ф. Биологические свойства вируса иммунного дефицита, выделенного от жителя БССР // Здравоохранение Белоруссии. - 1989.11. - С. 11-12. 9. Бореко Е.И. Сравнительная характеристика и закономерности проявления противовирусной активности синтетических и природных соединений (экспериментальное исследование) Автореф. дис. д-ра мед. наук 03.00.06 / ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ. - Минск, 2003. - 52 с. 11. Заугольников С.Д., Качанов А.О. // Медицина, 1978. - С. 184. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6