Способ определения вирулицидного действия дезинфектанта

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ДЕЗИНФЕКТАНТА(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Гудков Владимир Георгиевич Плотникова Ксения Юрьевна Виринская Анна Сергеевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(56) ИВАНОВА Е.Б. и др. Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2003.-5.С. 56-57. НОСИК Н.Н. и др. Сборник опубликованных материалов по актуальным вопросам дезинфектологии и применению дезинфекционных средств серии ВЕЛТ.- Вып. 2.- М., 2005.- С. 5-12. ТИТОВ Л.П. и др. Вирусные гепатиты и ВИЧ-инфекция. Эпидемиология, диагностика, профилактика, лечение. Вторая международная конференция.Минск, 1999.- С. 70. ТИТОВ Л.П. и др. Актуальные проблемы профилактики внутрибольничных инфекций, дезинфекции и стерилизации. Тез. докл. Республиканской научно-практической конференции.Минск, 1997.- С. 53-54.(57) Способ определения вирулицидного действия дезинфектанта, включающий обработку тест-вирусов испытуемым дезинфектантом и сравнительную оценку содержания жизнеспособных тест-вирусов до и после обработки дезинфектантом, отличающийся тем, что содержание жизнеспособных тест-вирусов оценивают по образованию иммунного комплекса при специфической иммуносорбции тест-вирусов и детектированию методом полимеразной цепной реакции генома тест-вирусов в составе иммунного комплекса, причем при уменьшении содержания жизнеспособных тест-вирусов после обработки дезинфектантом более чем в 10 раз, считают, что дезинфектант обладает вирулицидным действием. 12311 1 2009.08.30 Изобретение относится к микробиологии и дезинфектологии и может быть использовано для определения эффективности дезинфектантов в отношении вирусов. Дезинфекция - процесс устранения болезнетворных микроорганизмов с зараженных инструментов, одежды или окружающих предметов путем оказания физического или химического воздействия на них (использования дезинфицирующих средств) (Медицинский словарь , 1999, с. 269). Методы исследования вирулицидных свойств многообразны и зависят от назначения конкретного дезсредства. Суть их состоит в следующем. Вирус определенной концентрации обрабатывают дезинифектантом, после чего производится оценка вирулицидного действия дезсредства. Эффективность дезинфектанта определяется кратностью уменьшения количества жизнеспособных микроорганизмов и скоростью их отмирания после применения того или иного дезинфицирующего средства(Черкасский Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека. Справочник эпидемиолога, 1994, с. 95). Известен способ определения вирулицидного действия дезинфектантов с помощью метода культуры клеток (Исследование вирулицидных свойств дезинфицирующих и антисептических препаратов, методические рекомендации, 1996 с. 15-18). Принцип определения вирулицидного действия дезинфектантов заключается в сравнении инфекционной активности исходной вируссодержащей взвеси с инфекционной активностью той же вируссодержащей взвеси после ее обработки испытуемыми дезинфектантами. С этой целью после обработки исходной вирусной взвеси дезинфектантом готовят параллельные последовательные разведения суспензии вируса, обработанной дезинфектантом и исходной взвеси вируса на охлажденной культуральной среде. Затем этими разведениями инфицируют культуры клеток. Инфекционность вирусной взвеси определяется макро- или микрометодом, по образованию бляшек, цитопатическому эффекту или другим показателям размножения вируса. Недостатком известного способа является то, что он требует индивидуальных условий индикации возбудителя различных культур клеток, специальных условий культивирования, состава питательных сред. Кроме того, тестирование дезинфектантов в отношении многих эпидемиологически значимых вирусов практически невозможно из-за их некультивируемости в культуре клеток при отсутствии или недоступности реальных биологических моделей. Так, например, к некультивируемым относится вирус гепатита В, а экспериментально эта инфекция может быть воспроизведена только на шимпанзе, что для целей тестирования дезинфектантов практически неприемлемо по многим обстоятельствам Шандала М.Г. Эпидемиология и инфекционные болезни.-2.- 2005.- С. 42. В тех случаях, когда пермиссивная экспериментальная система вируса отсутствует(вирус не адаптирован к культуре клеток), эффективность дезинфектанта определяют по потере или снижению содержания антигенов или ДНК (РНК) вируса Исследование вирулицидных свойств дезинфицирующих и антисептических препаратов. Методические рекомендации, 1996.- С. 39. Известен способ определения вирулицидного действия дезинфектантов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) Исследование вирулицидных свойств дезинфицирующих и антисептических препаратов. Методические рекомендации, 1996.- С. 18. Антигенную активность испытуемых и контрольных проб определяют с помощью стандартных коммерческих иммуноферментных тест-систем. Однако на Межотраслевой международной конференции в 1997 году было единогласно решено, что тестирование уменьшения антигенностине может быть принято как основание для регистрации, сертификации и разрешения к продаже и применению дезинфектантов Шандала М.Г. Эпидемиология и инфекционные болезни.-2.- 2005.- С. 42. На примере вируса гепатита А также показано, что после обработки вируса гепатита А дезинфектантами (в частности, формалином), нарушающими целостность вирусной оболочки и приводящими к разрушению его нуклеиновой кислоты и потере инфекционной 2 12311 1 2009.08.30 активности, в этой пробе методом ИФА определяются антигены вируса, так как подобное воздействие сохраняет эпитопы антигенов, необходимые для их взаимодействия с паратопами специфических иммуноглобулинов. Обработанный таким образом вирус уже не является инфекционным, но сохраняет антигенные свойства. Таким образом, в этом и подобных случаях адекватно определить вирулицидность испытуемых дезинфектантов с помощью ИФА невозможно. Известен способ определения вирулицидного действия дезинфектантов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) - прототип Иванова Е.Б. и др. Эпидемиология и инфекционные болезни.-5.- 2003.- С. 56-57. Суть способа в следующем. Готовится суспензия тест-вируса (вирус гепатита В) и осуществляется контаминация тест-объектов взвесью тест-вируса затем контаминированные тест-вирусом тест-объекты обрабатываются испытуемым дезинфектантом согласно инструкции по применению. После экспозиции с дезинфектантом берутся пробы с обработанных дезинфектантом и необработанных им контаминированных объектов. Взятые пробы исследуются на содержание тест-вирусов методом ПЦР. На основании полученных результатов определяется наличие вирулицидного действия у испытуемого дезинфектанта. Недостатком этого способа является то, что с его помощью невозможно адекватно определить наличие вирулицидных свойств у дезинфектантов, обладающих реальной способностью инактивировать вирус, но не разрушающих его геном. Так, например,инкубирование вируса с 70 этанолом приводит к денатурации белковых структур вируса, в т.ч. антигенов, однако РНК, не растворяющаяся в спиртах, сохраняет свою целостность. В результате традиционная ПЦР дает положительный результат, выявляя неповрежденный геном инактивированного возбудителя. Подобная картина наблюдается при пастеризации и обработке вирусов гепатитов В и С, полиовирусов растворителями и детергентами.. .- 1997 .- . 37(9).- . 40. Таким образом, два последних метода прямо не отражают инфекционную активность вируса и результаты определения вирулицидных свойств дезинфектантов с их помощью могут не соответствовать истинной картине. Задачей, решаемой изобретением, является разработка способа определения вирулицидного действия дезинфектантов, не требующего использования культур клеток и пригодного для тестирования инфекционных частиц (вирионов) некультивируемых вирусов путем индикации инфекционного вируса, а не его отдельных структурных компонентов,что, как было показано выше, вполне вероятно при исследованиях традиционными методами ИФА и ПЦР. Результат достигается в способе определения вирулицидного действия дезинфектанта,включающем обработку тест-вирусов испытуемым дезинфектантом и сравнительную оценку содержания жизнеспособных тест-вирусов до и после обработки дезинфектантом. Содержание жизнеспособных тест-вирусов оценивают по образованию иммунного комплекса при специфической иммуносорбции тест-вирусов и детектированию методом полимеразной цепной реакции генома тест-вирусов в составе иммунного комплекса, причем при уменьшении содержания жизнеспособных тест-вирусов после обработки дезинфектантом более чем в 10 раз, считают, что дезинфектант обладает вирулицидным действием. Результат выражается в одновременной индикации возбудителя сразу по двум основным маркерам (антигену и геному), имеющим различную химическую природу, биологические свойства и обладающим различной чувствительностью к инактивирующим вирус агентам. ПЦР с иммунологическим компонентом (специфическая иммуносорбция вируса и последующее детектирование его генома в составе иммунного комплекса методом ПЦР), сочетая в себе компоненты иммунологической реакции и амплификации генов, выявляет только полноценные инфекционные вирионы. При обработке веществами, разрушающими нуклеиновую кислоту, сорбированные на твердой фазе специфические антитела связывают антиген, но последующая ПЦР дает отрицательный результат в связи 3 12311 1 2009.08.30 с отсутствием субстрата (РНК). Вещества, воздействующие только на антиген, нарушают его взаимодействие с иммуноглобулинами, свободная РНК удаляется на стадии отмывок,что препятствует появлению ложноположительных результатов после постановки обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Примеры осуществления изобретения. Исследуемый дезинфектант разводят на бидистиллированной воде. При разведении необходимо учитывать, что исследуемая концентрация дезинфектанта должна содержаться в смести дезинфектантсуспензия вируса. К одной части суспензии, содержащей вирус в высокой концентрации, добавляют восемь частей разведенного дезинфектанта в концентрации в 1,25 раз выше, чем конечная (исследуемая). Смесь выдерживают при комнатной температуре необходимое время в соответствии с инструкцией по применению дезинфектанта. По завершении периода экспозиции с целью удаления дезинфектанта раствор разводят в 1000 раз. Инфекционность смеси проверяют путем постановки ПЦР с иммунологическим компонентом. В основе этого метода лежит связывание вируса сорбированными на твердой фазе специфическими антителами. Последующие стадия отмывки позволяет удалить ингибиторы, а индикация по двум маркерам (антиген и геном) обнаружить инфекционный вирус. Эффективность дезинфектантов определяется кратностью уменьшения количества жизнеспособных микроорганизмов и скоростью их отмирания после применения того или иного дезинфицирующего средства. Показатели эффективности задаются методическими рекомендациями, утвержденными Минздравом в качестве официального документа. На твердой подложке, например в лунках планшета для иммунологических реакций,сорбируют специфические антитела к тест-вирусу. Затем в лунки вносят вируссодержащую суспензию и выдерживают время, необходимое для образования иммунного комплекса вируса с антителами. Полученный иммунный комплекс отмывают несколько раз и обрабатывают для высвобождения вирусной нуклеиновой детектируют в полимеразной цепной реакции. В результате детектируются только вирионы, содержащие вирусные белки и вирусную нуклеиновую кислоту, которые в данном случае существуют в виде нуклеопротеинового комплекса, что является неотъемлемым признаком полноценных инфекционных вирусных частиц. При детекции вируса методом иммуноферментного анализа выявляются только вирусные белки (вне зависимости от того, связаны они с нуклеиновой кислотой или нет), а при использовании традиционной полимеразной цепной реакции выявляется исключительно вирусная нуклеиновая кислота, которая может и не находиться в нуклеопротеиновом комплексе с вирусными белками. При этом в обоих случаях вирус может быть инактивирован. Отдельно ни белок, ни нуклеиновая кислота вируса не обладают инфекционной активностью в обычных условиях, и по изменению их концентрации невозможно судить об эффективности дезинфектантов. Осуществление предлагаемого способа возможно в любой лаборатории, имеющей оснащение (реагенты и оборудование), необходимое для его проведения. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4