Способ получения 7-аминодеацетилцефалоспоррановой кислоты

В настоящее время ИМССТСЯ ЗНЗЧИТВЛЬНОС КОЛИЧЕСТВОантибиотиков. У коммерческих цефалоспоринов обнаруживается огромноеопределяется разработкой более экономичныхПрОИЗВОДСТВЗ КШОЧВВЫХ ПрОМСЖУТОЧНЫХ ПрОДуКТОВ, КОТОрЫС ПОЗВОК ключевым промежуточным продуктам цефалоспоринов относится 7 тилцефалоспориновая кислота (7-АДАЦ) и 7-аминоцеф гут быть представлены следующими формуламиЦефалоспорин С, сам по себе являющийся ферментационным продуктом, является исходным веществом почти для всех имеющихся в настоящее время торговых препаратов цефалоспоринов. Однако, синтетические манипуляции по производству различных коммерческих цефалоспоринов в большинстве случаев начинаются, по существу, с 7-аминоцефалоспорановой кислоты, которая должна быть получена из цефалоспорина С путем отщепления 7-аминоадипоиловой боковой цепи.В настоящее время предпочтительным способом отщепления 7-амидоадипоиловой боковой цепи является химический способ. Однако, процесс химического отщепления имеет серьезные недостатки, такие как проведение многоэтапного и сложного процесса, чрезвычайно низкие действительные температуры,дорогостоящие реактивы, значительные количества побочных продуктов этого процесса, приводящие к проблемам обработки образующейся реакционной смеси и очистки сильно загрязненного исходного материала перед началом химической обработки. Поэтому ведется непрерывный поиск микробиологического или ферментативного процесса, по которому достигалось бы ферментное деацилироваъше цефалоспорина С с образованием 7-аминодеацетил цефалоспорановой кислоты на более экономичной основе.Однако, этот поиск успешного микробиологического процесса оказывается в значительной степени тщетным. Как становится ясно из литературы, это является результатом особенностей структуры и, в частности, стереохимии аминоадипоиловой боковой цепи молекулы цефалоспорина С, так как пенициллгш успешно деацилируется ферментным . расщеплением с использованием пенициллин-апилазът, образуемой множеством микроорганизмов. С другой стороны, сообщения в литературе об успешном одноэтапном ферментном деацилировании цефалоспорина С часто являются невоспроизводимыми или обеспечивают только очень небольшие выходы конечного продукта.К настоящему времени поиск успешного биопроцесса для изготовления 7-АДАЦ остается в значительной степени тщетным конечно же и в отношении биопроцессаферментацией и/или ферментной обработкой получить 6-амино-пенициллановую кислоту (б-АПК), у которой остается необходимым только расширить кольцо,чтобы получить 7-АДЦК, было обнаружено, что, к несчастью, ферменты(Териаюзрогтит или Шгерютусез, которые осуществляют расширение кольца в нормальных метаболических путях этих микроорганизмов, не воспринимают 6 АПК в качестве субстрата. Эти ферменты, которые в совокупности обозначаются как ДАОЦС или фермент экспандаза в данной области техники, определяются как ферменты, которые катализируют расширение структур пенамовых колец,найденных в молекулах пенициллинового типа, в цеф-З-емовые кольца, найденные у цефалоспоринов. В дальнейшем эти ферменты будут коллективно упоминаться как фермент экспандаза.Субстратом, на который действует фермент экспандаза, является пенициллин М,который после расширения кольца и гидроксилирования дает деацетилцефалоспорановую кислоту (ДАЦ). Теперь для получения 7-АДАЦ необходимо только отщепить (Ш-а-аминоадипоиловую боковую цепь, но эта боковая цепь оказалась упорно невосприимчивой к ферментному отщеплению, что приводит только к неприемлемо низким выходам конечного продукта.В соответствии с настоящим изобретением стало возможным проводить эффективный биопроцесс, по которому пенициллиновое соединение (имеющее адипоиловую боковую цепь) образуется посредством нового ферментационных) процесса в высоких титрах, названное пенициллштовое соединение является приемлемым субстратом для экспандазного фермента, который образуется в месте нахождения тем же самым организмом, который производит и пенициллиновое соединение, трансформированным для экспрессии названного фермента экспандазы. Фермент экспандаза затем осуществляет расширение кольца пенициллинового соединения с образованием цефалоспоринового соединения с высоким выходом последнего.Адипоил-7-АДЦК, образуемая действием фермента экспандазы в местепродукт, имеет З-ацетилоксиметильную боковую цепь СН 2 ОС(О)СН 3. Для того,чтобы превратить 3-метильную боковую цепь в 3-ацетилоксиметильную боковуюцепь, в соответствии с настоящим изобретением также в месте нахождения экспрессируются две другие ферментные активности в добавление к экспандазной активности. Для этого имеются гидроксилаза и ацетилтрансфераза, которые являются продуктами экспрессии генов и которыми также был трансформирован микроорганизм, образующий пенициллиновое соединение. Гидроксилазный адипоил-7-АДЦК в 3 ферментгидроксиметильную, а ацетилтрансферазный превращает 3 гидроксиметильную боковую цепь в З-ацетилоксиметильную боковую цепь 7-АЦК. И на последнем решающем этапе способа настоящего изобретения важно то, что боковую цепь пенициллинового соединения, теперь уже цефалоспоринового соединения, можно удалить другой ферментной системой с неожиданно высокими выходами конечного продукта. непредвиденным результатом этого общегоЕР-А-О 422 790 описывает ДНК. кодирующую изопенициллин Мацил-КоА ацилтрансферазную активность Аврегяй/инг иге/июля, и ее использование для получения полезных цефалоспоринов с участием образующих пенициллин грибов. Но оно описывается как осуществляемое путем разрушения или перемещения ацетилтрансферазного гена вместе с добавлением генов, кодирующих ферменты эпимеразу и экспандазу, из образующих цефалоспорин организмов. Но если описанная трансформация была бы удачной , она все равно не была бы применима для целей настоящего изобретения, так как по-прежнему оставалась бы проблема удаления В-а -аминоадипоиловой боковой цепи. Первый ферментный этап биопроцесса по способу настоящего изобретения представляет собой расширение кольца у адипоил-6-АПК, которое осуществляется ферментом экспандазой, являющимся продуктом экспрессии экспандазиого гена,был трансформирован хозяйский