Способ глубокого замораживания эмбрионов крупного рогатого скота

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ГЛУБОКОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(71) Заявитель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству(72) Авторы Шейко Иван Павлович Будевич Александр Иванович Горбунов Юрий Анатольевич Минина Наталья Генриховна Шелудяков Михаил Валерьевич(73) Патентообладатель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству(56) Эрнст Л.К. и др. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. - М. ВО Агропромиздат, 1989. С. 190-195.5527260 А, 1996.1782568 1, 1992. Будевич А.И. и др. Зоотехническая наука Беларуси Сб. науч. тр. - Т. 36. - Мн. Хата, 2001. - С. 34-39.а 19990903, 2000.5504002 , 1996.(57) Способ глубокого замораживания эмбрионов крупного рогатого скота, включающий насыщение эмбрионов криопротектором, охлаждение в парах жидкого азота и погружение в жидкий азот при температуре минус 196 , отличающийся тем, что эмбрионы помещают на 3 мин в первую среду с криопротектором, затем - на 50-60 с во вторую среду с криопротектором, затем переносят в пайетту, на 60 с помещают в пары жидкого азота и погружают в жидкий азот, при этом первую среду готовят путем доведения 1 мл химически чистого глицерина до 10 мл фосфатно-солевым буфером Дюльбекко с добавлением 4 г/л бычьего сывороточного альбумина, 12 мкг/мл гентамицина и 100 ед/мл ампициллина,вторую - путем смешивания 3 мл химически чистого глицерина, 1,5 мл химически чистого диметилсульфоксида и 0,5 мл поливидона и доведения смеси до 10 мл фосфатно-солевым буфером Дюльбекко с теми же добавками. Изобретение относится к биотехнологии эмбриопересадок у крупного рогатого скота,в частности к криоконсервированию зародышей коров-доноров. Эмбрион, который на 20 состоит из твердых составных частей и на 80 из воды,подвержен двум негативным влияниям - образованию интрацеллюлярных кристаллов и воздействию высоких концентраций солей. При проведении криоконсервирования эмбрионов очень важно сделать правильный выбор криопротектора и его концентрации, оптимального режима замораживания и оттаивания. При несоблюдении каждого из перечисленных условий высокая концентрация солей, обусловленная потерей воды, вызывает нарушение 9315 1 2007.06.30 проницаемости клеточных мембран, клетка не успевает регулировать осмотическое равновесие, в результате чего зародыш подвергается осмотическому шоку. Неправильный выбор скоростей охлаждения служит причиной необратимых процессов, возникающих на микромолекулярном уровне изменению рН в эндоцеллюлярной жидкости, что приводит к денатурации белковых молекул разрушению связанной воды и сжатию клеток, деформации мембран и инактивации ферментов спонтанному образованию больших кристаллов льда, что является следствием разрыва цитоплазматических мембран, мембран клеточных органелл и протеиновых гелей. Результатом всех этих негативных процессов является гибель клетки 1. Известен способ криоконсервирования эмбрионов крупного рогатого скота, включающий насыщение зародышей криопротектором, помещение их в программный охладитель с длительным процессом замораживания и перемещением в жидкий азот для хранения при - 1962. Недостатком данного способа является длительность процесса насыщения биоматериала криопротектором, продолжительное замораживание (от 40 до 50 мин в зависимости от цикла замораживания и программного устройства), необходимость наличия автоматического замораживающего устройства с обязательным источником питания, из-за чего криоконсервирование эмбрионов не может быть осуществлено в полевых условиях в случаях внезапного отключения источников электроэнергии. Задача изобретения - повышение эффективности криоконсервирования эмбрионов в биотехнологии трансплантации зародышей крупного рогатого скота. Сущность изобретения. Способ глубокого замораживания эмбрионов крупного рогатого скота, который предусматривает насыщение зародышей криопротектором, охлаждение в парах жидкого азота и погружение в жидкий азот при температуре - 196 . Причем эмбрионы помещают на 3 мин в первую среду с криопротектором, затем - на 50-60 с во вторую среду с криопротектором, затем переносят в пайетту, на 60 с помещают в пары жидкого азота и погружают в жидкий азот. При этом первую среду готовят путем доведения 1 мл химически чистого глицерина до 10 мл фосфатно-солевым буфером Дюльбекко с добавлением 4 г/л бычьего сывороточного альбумина, 12 мкг/мл гентамицина и 100 ед/мл ампициллина, вторую - путем смешивания 3 мл химически чистого глицерина, 1,5 мл химически чистого диметилсульфоксида и 0,5 мл поливидона. Доводят смесь до 10 мл фосфатно-солевым буфером Дюльбекко с теми же добавками. Способ осуществляют следующим образом. Готовят первую защитную среду (10 раствора глицерина). Для этого отмеряют 1 мл химически чистого глицерина и доводят раствор до 10 мл фосфатно-солевым буфером Дюльбекко, приготовленным ранее с добавлением бычьего сывороточного альбумина (4 г/л), гентамицина (12 мкг/мл) и ампициллина (100 ед/мл). Готовят вторую защитную среду. Для этого отмеряют 3 мл химически чистого глицерина, 1,5 мл химически чистого диметилсульфоксида, 0,5 мл раствора поливидона, смешивают компоненты и доводят раствор до 10 мл фосфатно-солевым буфером Дюльбекко,приготовленным так, как указано выше. Затем эмбрионы помещают в заранее приготовленную первую защитную среду на 3 мин, далее - во вторую защитную среду на 50-60 с. Переносят эмбрионы в пайетту, помещают ее в пары жидкого азота на 60 с и далее погружают в жидкий азот при температуре -196 С. Для определения эффективности предлагаемого способа был проведен научнопроизводственный опыт. После извлечения зародыши отличного и хорошего качества на стадии морулы и бластоцисты были отобраны для замораживания. Было сформировано две группы эмбрионов - опытная (34) и контрольная (38), однородные по качественному и возрастному составу. Опытный биоматериал был заморожен в витрификационной среде, содержащей глицерин, диметилсульфоксид, поливидон и фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с добавлением бычьего сывороточного альбумина, гентамицина, ампи 2 9315 1 2007.06.30 циллина, без программного замораживателя, после хранения оттаян и пересажен реципиентам (34) без промежуточной оценки (прямая пересадка). Контрольные эмбрионы были насыщены стандартной защитной средой - 1,5 М раствором этиленгликоля в течение 10 минут, заправлены в пайетты и заморожены на программном замораживателе ЭМБИК (Россия) до -30 с последующим переносом в жидкий азот. Продолжительность цикла криоконсервирования - 40 минут. После хранения пайетты были оттаяны аналогичным образом, заправлены в катетер, и эмбрионы без морфологической оценки были пересажены тлкам-реципиентам (38). Животные находились в равных условиях кормления и содержания. Результаты опыта приведены в таблице. Группы эмбрионов Показатели Заморожено и оттаяно эмбрионов,Сделано эмбриопересадок Количество стельных реципиентов, гол. -Продолжительность криоконсервирования(от начала насыщения до помещения в жидкий азот), мин. Необходимость наличия замораживающего устройства Таким образом, предложенный способ позволяет сократить в 15 раз затраты времени на криоконсервирование биоматериала без существенного снижения результативности пересадок, выполнять трансплантацию в условиях производства, отпадает необходимость в приобретении дорогостоящих замораживающих устройств с повышением эффективности технологии трансплантации в целом. Источники информации 1. Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота Метод. рекомендации.Жодино, 1997. 2. Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. - М. Агропромиздат, 1989. - С. 190-195. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3