Способ определения предрасположенности индивидуума к раку легкого

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ ИНДИВИДУУМА К РАКУ ЛЕГКОГО(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Михаленко Елена Петровна Чакова Наталья Николаевна Крупнова Эвелина Вячеславовна Чеботарева Наталья Вячеславовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56)2296328 1, 2007.2260799 1, 2005. НИКИШИНА М.В. Исследование полиморфизма генов ариламин -ацетилтрансфераз и ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска Автореф. дис. - Новосибирск, 2007. - С. 1-22. НИКОНОВА Т.А. и др. Материалы Всероссийской 67-ой итоговой студенческой научной конференции им. Н.И.Пирогова. - Томск Сибирский государственный медицинский университет, 2008. - С. 393-394.2293991 1, 2007.(57) Способ определения предрасположенности индивидуума к раку легкого, отличающийся тем, что выделяют ДНК индивидуума, определяют с применением полимеразной цепной реакции полиморфизм генов 1, 12 и 1 и судят о наличии предрасположенности индивидуума к раку легкого при выявлении сочетания генов 73412/1(делеция)/34351. Изобретение относится к области молекулярно-генетических исследований в медицине и может быть использовано в онкологии. В настоящее время рост мультифакторных заболеваний (МФЗ), в том числе и различных онкопатологий, связывают с возрастающим загрязнением окружающей среды чужеродными для организма веществами (ксенобиотиками) и, как следствие, увеличением их поступления в организм человека. Ксенобиотики, попадая в организм, подвергаются процессам биотрансформации. Процесс биотрансформации обычно подразделяется на три фазы активации, нейтрализации и эвакуации. Изменение активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), связанное с наличием генетического полиморфизма, приводит к уменьшению или увеличению восприимчивости организма к вредным воздействиям и, как следствие, к риску развития различных МФЗ, в том числе и рака легкого (РЛ). Согласно концепции, предложенной академиком Л.А.Пирузяном, индивидуальный ответ человека на воздействие факторов окружающей среды определяется стартовым состоянием ферментативных систем биотрансформации ксенобиотиков, раз 17599 1 2013.10.30 личающихся по характеру активности в популяциях 1. Существуют значительные межпопуляционные различия в распределении частот полиморфных аллелей генов ФБК, которые обусловлены географическими условиями, этнической принадлежностью и др. Поэтому представляется целесообразным поиск ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с возникновением мультифакторной патологии, в частности РЛ, в конкретном регионе. Наиболее близким к предлагаемому изобретению по техническому исполнению из существующих прогностических методов является определение предрасположенности к онкологическими заболеваниям с использованием диагностического набора для проведения медико-генетического анализа полиморфизма генов, кодирующих ферменты первой и второй фаз биотрансформации 2. Недостатком этого способа является то, что с помощью его можно анализировать только предрасположенность к онкологическим заболеваниям, а не выявлять предрасположенность к конкретной онкопатологий. Кроме того, этот способ не позволяет провести анализ работы ферментов трех фаз биотрансформации. Известно, что к развитию опухоли приводит дисбаланс активации, инактивации и выведения токсичных соединений. Поэтому представляется важным изучение суммарного вклада полиморфных вариантов генов ферментовифаз биотрансформации ксенобиотиков, а также -гликопротеина в развитие предрасположенности к РЛ. Предлагаемый нами способ основан на комплексном подходе, включающем молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов, кодирующих соответствующие ферменты трех фаз биотрансформации ксенобиотиков 1-я фаза - 12 (734) 2-я фаза 1 (делеция) 3-я фаза - 1 (3435). Данный способ заключается в определении молекулярных маркеров предрасположенности к РЛ. Решение этих задач обеспечивается предлагаемой модификацией способа молекулярно-генетической диагностики. После выделения ДНК проводят одну мультиплексную и две стандартные полимеразные цепные реакции (ПЦР) с использованием четырех пар праймеров. Далее проводится гидролиз продуктов стандартных полимеразных цепных реакций эндонуклеазами рестрикции и электрофорез продуктов гидролиза в агарозном геле. Использованные праймеры и эндонуклеазы рестрикции представлены в табл. 1. Таблица 1 Последовательность праймеров и характеристика аллелей анализируемых генов Последовательность прай- Размер Нуклео- ЭндоГен тидная продукта нуклеаза меров 5,3,замена-12 385 п.н. 734 Длины рестриктных фрагментов 262123 (аллель Способ состоит из 7 этапов и осуществляется следующим образом. Этап 1. Выделение ДНК по стандартному протоколу. Этап 2. Типирование образцов по гену 1 с применением мультиплексной ПЦР. В качестве внутреннего контроля используется амплификация фрагмента гена альбумина. Смесь для амплификации объемом 15 мкл включала 100-200 нг ДНК (2 мкл) 0,15 мкМ прямого и обратного праймеров 1 0,09 мкМ прямого и обратного праймеров 2 17599 1 2013.10.30 7,5 мкл -2(ОДО Праймтех, Минск). Начальное плавление проводят в течение 5 мин при температуре 95 С, далее проводят 30 циклов, включающих плавление при температуре 95 С в течение 30 с, отжиг при температуре 64 С в течение 1 мин, синтез при температуре 72 С в течение 1 мин. Финальный синтез проводят при температуре 72 С в течение 5 мин. Этап 3. Проведение стандартной ПЦР для амплификации 12. Смесь объемом 15 мкл включает 50-100 нг ДНК (1 мкл) 0,15 мкМ прямого и обратного праймеров 7,5 мкл -2(ОДО Праймтех, Минск). Начальное плавление проводят в течение 12 минт при температуре 94 С, далее проводят 35 циклов, включающих плавление при температуре 94 С в течение 30 с, отжиг при температуре 58 С в течение 30 с, синтез при температуре 12 С в течение 30 с. Финальный синтез проводят при температуре 72 С в течение 1 мин. Этап 4. Проведение стандартной ПЦР для амплификации 1. Смесь объемом 15 мкл включает 50-100 нг ДНК (1 мкл) 0,15 мкМ прямого и обратного праймеров 7,5 мкл -2(ОДО Праймтех, Минск). Начальное плавление проводят в течение 5 мин при температуре 94 С, далее проводят 40 циклов, включающих плавление при температуре 94 С в течение 30 с, отжиг при температуре 55 С в течение 30 с, синтез при температуре 72 С в течение 1 мин. Финальный синтез проводят при температуре 72 С в течение 7 мин. Этап 5. Гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК эндонуклеазами (табл. 1)(генетический полиморфизм 734 12)(генетический полиморфизм 3435 1) согласно протоколу фирмы-производителя. Этап 6. Фракционирование продуктов амплификации 1 и альбумина - в 1,2 и фракционирование продуктов рестрикции эндонуклеазами ,- в 2,5 -ном агарозном геле с бромистым этидием при напряжении 1 В/см и визуализация в УФ-свете. Этап 7. Анализ полученных результатов. Проведено клинико-генетическое изучение группы больных РЛ (118 человек), проходивших лечение в Минском онкологическом диспансере в период с 2003 по 2009 гг. Диагноз РЛ основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического,эндоскопического и морфологического обследований. В контрольную выборку вошли 309 человек без онкопатологии, постоянно проживающих на территории Беларуси. Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к РЛ судили по величине отношения шансов ( -).является мерой ассоциации, количественно определяющей взаимосвязь между фактором риска и развитием определенного признака 3. Степень ассоциаций оценивается в значениях показателя соотношения шансов по формуле/,где- число лиц с наличием маркера,- с отсутствием маркера среди больныхичисло лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых.указан с 95 -ным доверительным интервалом (95). Достоверность определялась по критерию 2 для таблиц сопряженности 22 с поправкой Йетса на непрерывность. В табл. 2 представлены наиболее значимые сочетания полиморфных вариантов генов для выявления предрасположенности к РЛ. Сочетания генотипов 12(734)/1(делеция) и 1(делеция)/1(3435) являются неблагоприятными и повышают риск развития РЛ у носителей таких комбинаций. Наибольшую рисковую значимость имеет комбинация 12 (734)/ 1(делеция)/1(3435). 17599 1 2013.10.30 Таблица 2 Наиболее значимые комбинации полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формировании предрасположенности к раку легкого Генотип 12(734)/1(делеция) 1(делеция)/1(3435) 12(734 АА)/1(делеция)/1(3435) Использование данного способа дает возможность у людей из группы риска по возникновению рака легкого выявлять молекулярные маркеры предрасположенности, что обеспечивает своевременность проведения ранних профилактических мероприятий (исключение воздействия табачного дыма и поллютантов, проведение углубленных медицинских осмотров). Источники информации 1. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Саприн В.А. Прогностический фактор риска развития патологических процессов, основанный на полиморфизме ферментов метаболизма ксенобиотиков. // Физиология человека. - 2000. - Т. 26. -2. - С. 115-123. 2. Патент РФ 2296328, МПК 01 33/5012 1/68, 2007. 3. Реброва О.Ю. Сравнение групп по качественному бинарному признаку // Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ/ Под ред. М.Н. Солововой. - М. Медиа Сфера, 2004. - Гл. 11. - С. 157-185. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4