Способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ из бульонной культуры патогенного штамма Pseudomonas aeruginosa

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЖЕЛАТИНОЛИТИЧЕСКИХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ БУЛЬОННОЙ КУЛЬТУРЫ ПАТОГЕННОГО ШТАММА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(56) ПЫЖОВА Н.С. и др. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. . Международная конференция. Тез. докл. Минск, 2007. - С. 63-65.11032777 , 1999.751991 1, 1997.6031087 , 2000.2182598 2, 2002. НИКАНДРОВ В.Н. и др. Современные проблемы инфекционной патологии человека (вирусология, микробиология, иммунология, эпидемиология и клиника). Материалынаучно-практической конференции. - Минск, 2001. С. 318-338.(57) Способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ из бульонной культуры патогенного штамма, отличающийся тем,что в качестве ингибитора используют 0,5-1,0 -ный раствор новокаина, приготовленный на 0,005 М трис- буфере 7,4, содержащий этилендиаминтетраацетат натрия в концентрации 10-3-10-2 М. Изобретение относится к биологии и экспериментальной медицине, в частности к ингибированию активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммовкак одного из факторов патогенности данного микроорганизма. Известен способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов данного микроорганизма. Он заключается в том, что при добавлении к бесклеточным супернатантам бульонных культур патогенных (госпитальных штаммов)-хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в концентрации 10-2 М наблюдается полное ингибирование активности указанных протеиназ 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является ингибирование желатинолитической активности супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов псевдомонад при добавлении к реакционной системе вещества химической природы. 14799 1 2011.10.30 Однако применяемый для ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов псевдомонад -хлормеркурибензоат является высокотоксичным ртутьорганическим соединением, а диизопропилфторфосфат - высокотоксичным фосфорорганическим соединением. Оба эти соединения являются сильнодействующими ферментными ядами и могут быть использованы только для экспериментальных целей высококвалифицированным специально обученным персоналом. То есть использование -хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в качестве ингибитора внеклеточных желатинолитических протеиназ этого микроорганизма небезопасно для медицинского персонала и пациента. Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего ингибировать активность внеклеточных желатинолитических протеиназ госпитальных штаммов псевдомонад малотоксичным соединением, являющимся фармакопейным препаратом. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ из бульонной культуры патогенного штамма. В качестве ингибитора используют 0,5-1,0 -ный раствор новокаина, приготовленный на 0,005 М трис- буфере 7,4, содержащий этилендиаминтетраацетат натрия в концентрации 10-3-10-2 М. Использование смеси раствора новокаина с этилендиаминтетраацетатом натрия позволяет достичь резкого ингибирования (78-86 ) внеклеточных желатинолитических протеиназ госпитальных штаммов псевдомонад, исключив использование высокотоксичных ферментных ядов - -хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата. Раствор новокаина представляет собой водный раствор -диэтиламиноэтилового эфира пара-аминобензойной кислоты гидрохлорида и широко используется в медицине для местной анестезии (инфильтрационной, проводниковой, эпидуральной, субарахноидальной спинномозговой, иногда - внутрикостной), лечебных блокад, а также для внутривенного введения при поздних токсикозах беременности, спазмах кровеносных сосудов,язвенной болезни желудка и др. 2. Этилендиаминтетраацетат - динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты(Трилон Б) используют в лечебных целях внутривенно при избыточном отложении солей кальция в организме, артритах с отложением солей, отложении кальция в мышцах, почках, стенках вен, склеродермии, иногда - при эктопических аритмиях и др. 3. Этилендиаминтетраацетат известен и как ингибитор металлопротеиназ. Однако, согласно имеющимся у заявителя и авторов данным, в использованных концентрациях он вызывает подавление активности внеклеточных желатинолитических протеиназ бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов псевдомонад лишь на 40-45 . Пример 1. Используют образцы объединенного пула бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов 12/1 гоб 1, 74/5 гоб 4, 26/2 гоб 1, 23/2 гоб 2, 74/5 гоб 3, выращенных на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л, агарагара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 4. Для одной пластины желатинагаровую смесь готовят на 0,5 -ном растворе новокаина, содержащем этилендиаминтетраацетат натрия в концентрации 10-2 М и 0,005 М трис- буфера 7,4 (опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,005 М трис- буфере 7,4 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 4. 14799 1 2011.10.30 Площадь зон (мм 2) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 413 на контрольной желатин-агаровой пластине - 11113. Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ госпитальных штаммовподавлялась на 78 . Пример 2. Используют образцы объединенного пула бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов 12/1 гоб 1, 74/5 гоб 4, 26/2 гоб 1, 23/2 гоб 2, 74/5 гоб 3, выращенных на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л,агар-агара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 4. Для одной пластины желатин-агаровую смесь готовят на 1,0 -ном растворе новокаина, содержащем этилендиаминтетраацетат натрия в концентрации 10-2 М и 0,005 М трис- буфера 7,4(опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,005 М трис- буфере 7,4 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 4. Площадь зон (мм 2) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 0 на контрольной желатин-агаровой пластине - 10312. Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ госпитальных штаммовподавлялась на 100 . Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет подавлять активность внеклеточных желатинолитических протеиназ госпитальных штаммов псевдомонад, использовать доступный и безопасный для медицинского персонала и пациентов ингибитор, являющийся фармацевтическим препаратом. Данный способ может найти широкое применение при разработке рациональных путей борьбы с системной псевдомонадной инфекцией. Источники информации 1. Пыжова Н.С., Никандров В.Н. Протеолитическая активность госпитальных штаммовдействие группоспецифических ингибиторов протеиназ и фармацевтических препаратов. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. Международная конференция. Тез. докл. - Минск, 2007. - С. 63-65. 2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 15-е. Перераб., испр., доп. - М. Новая Волна, 2005. - С. 308-309. 3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 15-е. Перераб., испр., доп. - М. Новая Волна, 2005. - С. 753. 4. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шапчиц Н.С. Расщепление белков внутриклеточными протеиназамивлияние группоспецифических ингибиторов и перехватчиков активных форм кислорода // Доклады НАН Беларуси. - 2007. - Т. 51.3. - С. 92-97. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3