Способ ингибирования желатинолитической активности внеклеточных протеиназ патогенного штамма Pseudomonas aeruginosa

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ЖЕЛАТИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ ПАТОГЕННОГО ШТАММА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(56) ПЫЖОВА Н.С. и др. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. Тезисы докладов. - Минск, 2007. - С. 63-65.96117351 , 1998.2005120013 , 2006.(57) Способ ингибирования желатинолитической активности внеклеточных протеиназ патогенного штаммапутем добавления ингибитора, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используют смесь, содержащую лизоцим в концентрации 50-70 мкг/мл и этилендиаминтетраацетата динатриевую соль в концентрации 10-3-10-2 М. Изобретение относится к биологии и экспериментальной медицине, в частности к ингибированию активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммовкак одного из факторов патогенности данного микроорганизма. Известен способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов данного микроорганизма. Он заключается в том, что при добавлении к бесклеточным супернатантам бульонных культур патогенных штаммов псевдомонад р-хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в концентрации 10-2 наблюдается полное ингибирование активности указанных протеиназ 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является ингибирование желатинолитической активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов псевдомонад при добавлении к реакционной системе вещества с ингибиторными свойствами. Однако применяемый для ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ бесклеточных супернатантов бульонных культур патогенных штаммов псевдомонад р-хлормеркурибензоат является высокотоксичным ртутьорганическим со 14170 1 2011.04.30 единением, а диизопропилфторфосфат - высокотоксичным фосфорорганическим соединением. Оба эти соединения являются сильнодействующими ферментными ядами и могут быть использованы только для экспериментальных целей высококвалифицированным специально обученным персоналом. Т.е. использование р-хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в качестве ингибитора внеклеточных желатинолитических протеиназ этого микроорганизма не безопасно для медицинского персонала и пациента. Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего ингибировать активность внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммовмалотоксичным соединением, являющимся фармакопейным препаратом и не представляющим угрозы здоровью медицинского персонала. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования желатинолитической активности внеклеточных протеиназ патогенного штаммапутем добавления ингибитора, при этом в качестве ингибитора используют смесь,содержащую лизоцим в концентрации 50-70 мкг/мл и этилендиаминтетраацетата динатриевую соль в концентрации 10-3-10-2 . Использование смеси раствора лизоцима с этилендиаминтетраацетатом натрия позволяет достичь резкого ингибирования внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов, исключив использование высокотоксичных ферментных ядов - р-хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата. Лизоцим представляет собой фермент мол. массой 15 кДа, выделяемый из белка куриных яиц и обладающий бактериолитическим действием, главным образом, в отношении грамположительных микроорганизмов. Способен стимулировать неспецифическую реактивность организма, оказывать противовоспалительное и муколитическое действие. Применяют местно и внутримышечно при лечении гнойных и хронических септических процессов, при ожогах, обморожениях, конъюнктивитах, эрозиях роговицы и др. 2. Этилендиаминтетраацетат - динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты(Трилон Б) - используют в лечебных целях внутривенно при избыточном отложении солей кальция в организме, артритах с отложением солей, отложении кальция в мышцах, почках, стенках вен, склеродермии, иногда при эктопических аритмиях и др. 3. Этилендиаминтетраацетат известен и как ингибитор металлопротеиназ, однако согласно имеющимся у заявителя и авторов данным в использованных концентрациях сам он вызывает подавление активности внеклеточных желатинолитических протеиназ бесклеточных супернатантов бульонных культур патогенных штаммов псевдомонад лишь на 40-45 . Пример 1. Используют образцы бесклеточных супернатантов бульонных культур патогенного штамма 74/5 гоб 4, выращенного на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л,агар-агара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 4. Для одной пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,01 трис-буфере рН 7,5, содержащем лизоцим в концентрации 50 мкг/мл и этилендиаминтетраацетат в концентрации 10-3(опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,01 трис- буфере рН 7,5 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 4. Площадь зон (в мм 2) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 715 на контрольной желатин-агаровой пластине - 23714. 14170 1 2011.04.30 Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ патогенных штаммовподавлялась на 70 . Пример 2 Используют образцы бесклеточных супернатантов бульонных культур патогенного штамма 23/2 гоб 2, выращенного на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л,агар-агара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 4. Для одной пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,01 трис-буфере рН 7,5, содержащем лизоцим в концентрации 70 мкг/мл и этилендиаминтетраацетат в концентрации 10(опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,02 трис- буфере рН 7,5 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 4. Площадь зон (в мм) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 364 на контрольной желатин-агаровой пластине - 24815. Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ патогенных штаммовподавлялась на 84 . Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет подавлять активность внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов, использовать доступный и безопасный для медицинского персонала и пациентов ингибитор, являющийся фармацевтическим препаратом. Данный способ может найти широкое применение при разработке рациональных путей борьбы с системной псевдомонадной инфекцией. Источники информации 1. Пыжова Н.С., Никандров В.Н. Протеолитическая активность госпитальных штаммовдействие группоспецифических ингибиторов протеиназ и фармацевтических препаратов // Международная конференция. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. Тезисы докл. - Минск, 2007. - С. 63-65(прототип). 2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 15-е, перераб., испр., доп. - . Новая Волна, 2005. - С. 961. 3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 15-е, перераб., испр., доп. - . Новая Волна, 2005. - С. 753. 4. Никандров В, Пыжова Н.С., Шапчиц .С. Расщепление белков внутриклеточными протеиназамивлияние группоспецифических ингибиторов и перехватчиков активных форм кислорода // ДокладыБеларуси. - 2007. - Т. 51.3. - С. 92-97. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3