Способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенного штамма Pseudomonas aeruginosa

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЖЕЛАТИНОЛИТИЧЕСКИХ ПРОТЕИНАЗ ПАТОГЕННОГО ШТАММА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(56) ПЫЖОВА Н.С. и др. Международная конференция. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. - Минск, 2007. С. 63-65.96117351 , 1998.(57) Способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенного штамма, заключающийся в том, что указанные протеиназы инкубируют с ингибитором, в качестве которого используют С 1617420,5 2 в концентрации 10-4-10-3 М, при 37 С в течение 24 ч. Изобретение относится к биологии и экспериментальной медицине, в частности к ингибированию активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммовкак одного из факторов патогенности данного микроорганизма. Известен способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов данного микроорганизма. Он заключается в том, что при добавлении к бесклеточным супернатантам бульонных культур патогенных штаммов псевдомонад р-хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в концентрации 10-2 наблюдается полное ингибирование активности указанных протеиназ 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является ингибирование желатинолитической активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов псевдомонад путем добавления к реакционной системе вещества химической природы с ингибиторными свойствами. Однако применяемые для ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ бесклеточных супернатантов бульонных культур патогенных штаммов псевдомонад -хлормеркурибензоат является высокотоксичным ртутьорганическим соединением, а диизопропилфторфосфат - высокотоксичным фосфорорганическим соединением. Оба эти соединения являются сильнодействующими ферментными ядами и могут 14619 1 2011.08.30 быть использованы только для экспериментальных целей высококвалифицированным специально обученным персоналом. Т.е. использование -хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в качестве ингибитора внеклеточных желатинолитических протеиназ этого микроорганизма небезопасно для медицинского персонала и пациента. Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего ингибировать активность внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов псевдомонад малотоксичным соединением, не представляющим угрозы здоровью медицинского персонала. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенного штаммапутем того, что указанные протеиназы инкубируют с ингибитором, в качестве которого используют С 1617420,5 2 в концентрации 10-4-10-3 , при 37 С в течение 24 ч. Химическое соединение с общей формулой С 1617420,5 2 является красителем - метиленовый зеленый (основной зеленый 5). Использование С 1617420,5 2 позволяет достичь резкого ингибирования внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов псевдомонад, исключив использование высокотоксичных ферментных ядов - -хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата. Пример 1. Используют образцы бесклеточных супернатантов бульонных культур патогенного штамма 74/5 гоб 4, выращенного на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л,агар-агара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 2. Для одной пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,02 трис-буфере 7,5, содержащем метиленовый зеленый в концентрации 10-4(опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,02 трис- буфере рН 7,5 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 2. Площадь зон (в мм 2) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 516 на контрольной желатин-агаровой пластине - 21019. Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ патогенных штаммовподавлялась на 76 . Пример 2. Используют образцы бесклеточных супернатантов бульонных культур патогенного штамма 23/2 гоб 2, выращенного на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л,агар-агара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 2. Для одной пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,02 трис-буфере 7,5, содержащем метиленовый зеленый в концентрации 10-3(опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,02 трис- буфере 7,5 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 2. 14619 1 2011.08.30 Площадь зон (в мм 2) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 669 на контрольной желатин-агаровой пластине - 40917. Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ патогенных штаммовподавлялась на 84 . Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет подавлять активность внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов псевдомонад, использовать доступный и безопасный для медицинского персонала и пациентов ингибитор. Данный способ может найти применение при создании эффективных ингибиторов протеиназ как факторов патогенности псевдомонад. Источники информации 1. Пыжова Н.С., Никандров В.Н. Протеолитическая активность госпитальных штаммовдействие группоспецифических ингибиторов протеиназ и фармацевтических препаратов. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. Международная конференция. Тезисы докл. - Минск, 2007. - С. 63-65(прототип). 2. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шапчиц Н.С. Расщепление белков внутриклеточными протеиназамивлияние группоспецифических ингибиторов и перехватчиков активных форм кислорода // Доклады НАН Беларуси. - 2007. - Т. 51.3. - С. 92-97. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3