Способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ из бульонной культуры патогенного штамма Pseudomonas aeruginosa

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЖЕЛАТИНОЛИТИЧЕСКИХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ БУЛЬОННОЙ КУЛЬТУРЫ ПАТОГЕННОГО ШТАММА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(56) ПЫЖОВА Н.С. и др. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. Международная конференция. Тез. докл. - Минск,2007. - С. 63-65.11032777 , 1999.751991 1, 1997.6031087 , 2000.2182598 2, 2002. НИКАНДРОВ В.Н. и др. Современные проблемы инфекционной патологии человека (вирусология, микробиология, иммунология, эпидемиология и клиника). Материалынаучно-практической конференции. - Минск, 2001. С. 318-338.(57) Способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ из бульонной культуры патогенного штамма, отличающийся тем,что в качестве ингибитора используют генцианвиолет в концентрации 10-3-10-2 М. Изобретение относится к биологии и экспериментальной медицине, в частности к ингибированию активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммовкак одного из факторов патогенности данного микроорганизма. Известен способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ патогенных штаммов данного микроорганизма. Он заключается в том, что при добавлении к бесклеточным супернатантам бульонных культур патогенных (госпитальных) штаммов псевдомонад р-хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в концентрации 10-2 М наблюдается полное ингибированию активности указанных протеиназ 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является ингибирование желатинолитической активности супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов псевдомонад при добавлении к реакционной системе вещества химической природы. 14795 1 2011.10.30 Однако применяемые для ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов псевдомонад р-хлормеркурибензоат является высокотоксичным ртутьорганическим соединением, а диизопропилфторфосфат - высокотоксичным фосфорорганическим соединением. Оба эти соединения являются сильнодействующими ферментными ядами и могут быть использованы только для экспериментальных целей высококвалифицированным специально обученным персоналом. То есть использование -хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата в качестве ингибитора внеклеточных желатинолитических протеиназ этого микроорганизма небезопасно для медицинского персонала и пациента. Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего ингибировать активность внеклеточных желатинолитических протеиназ госпитальных штаммов псевдомонад малотоксичным соединением. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования активности внеклеточных желатинолитических протеиназ из бульонной культуры патогенного штамма. В качестве ингибитора используют генциан-виолет (кристаллический фиолетовый) в концентрации 10-3-10-2 М. Генцианвиолет (кристаллический фиолетовый, гексаметил-пара-розанилин) - химическое соединение с общей формулой 25303 является красителем, достаточно широко используемым в микробиологии для окрашивания клеток, в аналитической химии при спектрофотометрической определении иридия. Пример 1. Используют образцы бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитального штамма 23/2 гоб 2, выращенного на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л,агар-агара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 2. Для одной пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,01 М трис-буфере 7,5, содержащем генцианвиолет в концентрации 10-3 М (опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,01 М трис- буфере 7,5 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 2. Площадь зон (в мм 2) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 8110 на контрольной желатин-агаровой пластине - 47425. Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ госпитальных штаммовподавлялась на 83 . Пример 2. Используют образцы бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитального штамма 23/2 гоб 1, выращенного на питательном бульоне с гидролизатом кильки в стандартных условиях. Готовят две желатин-агаровые пластины (концентрация желатина составляла 5 г/л,агар-агара - 10 г/л), приготовленные, как описано нами ранее 2. Для одной пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,01 М трис-буфере рН 7,5, содержащем генцианвиолет в концентрации 10-2 М (опыт). Для второй пластины желатин-агаровую смесь готовят на 0,01 М трис- буфере 7,5 (контроль). Аликвоты образцов наносят на обе желатин-агаровые пластины. Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой желатин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса желатина 2. 2 14795 1 2011.10.30 Площадь зон (в мм 2) расщепления желатина (3) на опытной желатин-агаровой пластине - 8814 на контрольной желатин-агаровой пластине - 48119. Следовательно, желатинолитическая активность внеклеточных протеиназ госпитальных штаммовподавлялась на 82 . Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет подавлять активность внеклеточных желатинолитических протеиназ госпитальных штаммов псевдомонад, использовать доступный и безопасный для медицинского персонала и пациентов ингибитор. Данный способ может найти применение при создании эффективных ингибиторов протеиназ как факторов патогенности псевдоманад. Источники информации 1. Пыжова Н.С., Никандров В.Н. Протеолитическая активность госпитальных штаммовдействие группоспецифических ингибиторов протеиназ и фармацевтических препаратов. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. Международная конференция. Тез. докл. - Минск, 2007. - С. 63-65. 2. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шапчиц Н.С. Расщепление белков внутриклеточными протеиназамивлияние группоспецифических ингибиторов и перехватчиков активных форм кислорода // Доклады НАН Беларуси, 2007. - Т. 51. -3. С. 92-97. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3