Способ получения экспланта клевера лугового (Trifolium pratense L.)

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСПЛАНТА КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (.)(71) Заявитель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию(72) Авторы Шишлова Алла Михайловна Кулинкович Елена Николаевна Барчевская Елена Францевна Пайкова Мария Александровна Лазаревич Святослав Всеволодович Кубарев Валерий Степанович Добровольский Сергей Александрович Шишлов Михаил Петрович(73) Патентообладатель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию(57) Способ получения экспланта клевера лугового (.), отличающийся тем, что у 3-4-суточного проростка клевера лугового отчленяют на расстоянии на 1-2 мм ниже семядольного узла верхний сегмент гипокотиля, семядольный узел, апикальную меристему, котиледоны и петиоли. Изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано в научно-исследовательских и учебных заведениях для быстрого и массового размножения ценного селекционного материала, сохраняя при этом исходный генотип. Известны следующие способы получения эксплантов клевера лугового в культуреиз меристем пазушных почек, каллусных структур, проростков, соцветий и суспензионных клеточных культур 1. Наиболее технологичным способом получения растений-регенерантовсчитается прямой морфогенез растений из соматических клеток эксплантов, минуя стадию каллусообразования. При таком способе размножения из одного экспланта в результате нескольких пассажей получают более 1000 регенерантов. При этом существенную роль играет способ взятия эксплантов. В качестве прототипа был принят способ выделения экспланта путем отчленения гипокотиля или эпикотиля проростка и посадки его на питательную среду для получения регенерантов 2. К недостаткам прототипа относится низкая воспроизводимость проявления феномена прямой регенерации. 14126 1 2011.02.28 Целью изобретения является выделение высококомпетентного сложного комплексного экспланта, дающего массовую прямую регенерацию в условиях. Это особенно важно, когда имеется ограниченное количество ценных генотипов и требуется получить максимальное количество регенерантов, например, для трансформации культуры. Сущность изобретения заключается в эксклюзивной технике выделения экспланта из материнского растения путем декапитации сегмента гипокотиля с корнем, причем срез должен проходить строго на расстоянии 1-2 мм ниже семядольного узла, в результате чего получается сложно-комплексный эксплант, состоящий из верхнего сегмента гипокотиля,семядольного узла, апикальной меристемы, котиледонов и петиолей. Техника получения эксплантов включает следующие этапы 1 этап. Стерилизация семенного материала концентрированной серной кислотой 30-40 минут. 2 этап. Посадка семян на питательную среду 1/2 5 в условиях. 3 этап. Инкубация семян при температуре 20-23 С в течение 3-4 суток до появления гипокотиля с семядольными листьями. 4 этап. Удаление сегмента гипокотиля с корнем на расстоянии 1/3 его длины ниже семядольного узла. На фиг. 1 показано влияние размера экспланта на регенерацию при максимальной длине гипокотиля, на фиг. 2 - регенерация из экспланта при оптимальной длине гипокотиля, на фиг. 3 - регенерация из экспланта при срезе по семядольному узлу кущения. Экспериментаторы при получении не обращают внимания на длину отчленяемого гипокотиля. В результате проведенных нами экспериментов было установлено определяющее влияние длины гипокотиля на процессы регенерации. Эксперимент выполнен в трехкратной повторности в четырех вариантах опыта на разных генотипах. При максимально длинном гипокотиле (срез сразу над корневой шейкой) каллусная масса образовывалась на конце среза, а регенерация полностью отсутствовала или была очень слабой (фиг. 1). В дальнейшем такие экспланты практически не могли быть использованы для микроклонального размножения. Это объясняется тем, что при такой длине гипокотиля срез приходится на тот участок,где происходит переход от первичного строения корня ко вторичному строению стебля. В зоне такой перестройки прямая регенерация отсутствует, а идет только каллусообразование. Если сложно-комплексный эксплант с сегментом гипокотиля оптимальной длины(1-2 мм), в результате чего семядольный узел соприкасается со средой, то регенерация идет значительно быстрее и практически все экспланты дают регенеранты (фиг. 2). При такой длине гипокотиля разрез идет в зоне вторичного анатомического строения, при котором уже имеются хорошо сформированные коллатеральные проводящие пучки, из клеток паренхимной обкладки которых и происходит прямая регенерация. Если срез сделан сразу под семядолями, то эксплант не развивается и гибнет (фиг. 3). При таком срезе происходит отчленение верхушечной меристемы, и разрез приходится на молодые меристематические ткани, в которых нет проводящих пучков, способных снабжать растущую меристему. Предлагаемый способ получения эксплантов, при котором длина гипокотиля составляет 1-2 мм, позволяет повысить выход регенерантов, сэкономить рабочее время и расход реактивов. Источники информации 1. Мезенцев А.В., Любавина Л.А. Методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре. - М., 1983. 2.721035, 1980. 2 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3