Способ диагностики атеросклероза

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Учреждение образования Могилевский государственный университет имени А.А.Кулешова(72) Авторы Акулич Николай Васильевич Кручинский Николай Генрихович(73) Патентообладатель Учреждение образования Могилевский государственный университет имени А.А.Кулешова(57) Способ диагностики атеросклероза, при котором из венозной крови готовят мазок,фиксируют его смесью Никифорова, обрабатывают рибонуклеазой, окрашивают галлоцианин-хромовыми квасцами, заключают в канадский бальзам и проводят микроденситометрию интерфазного хроматина ядер лимфоцитов, после чего рассчитывают дискриминантную функцию ДФ по формуле ДФ-47,58(2)432,81(2) - 17,021569,29 - 6624,28,где (2) - значение площади окологранулярного интерфазного хроматина(2) - значение оптической плотности окологранулярного интерфазного хроматина- значение оптической плотности ядра,и при ДФ менее 7500 диагностируют атеросклероз, а при ДФ более 7500 - отсутствие поражения магистральных артерий. Предлагаемый способ относится к области медицины и может быть использован для диагностики начальных стадий атеросклероза. Атеросклероз - хроническое заболевание артерий эластического и мышечноэластического типа, характеризующееся инфильтрированием в стенку сосуда атерогенных липопротеинов с последующим развитием соединительной ткани, атероматозных бляшек,13995 1 2011.02.28 органных и общих расстройств кровообращения Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. - Т. 1. - М. Медицина, 2000. - 528 с Атеросклероз является полиэтиологическим заболеванием, в возникновении и прогрессировании которого имеют значение многие внешние и внутренние факторы, называемые факторами риска. В настоящее время известно более 30 факторов, действие которых увеличивает риск возникновения и развития атеросклероза и его осложнений. Наиболее значимыми являются возраст старше 50-60 лет пол (мужской) отягощенная наследственность дислипидемии (повышенное содержание в крови холестерина, триглицеридов и атерогенных липопротеинов и/или снижение содержания антиатерогенных липопротеинов) артериальная гипертензия курение ожирение нарушения углеводного обмена гиподинамия нерациональное питание гипергомоцистеинемия и др., ,,. /.,.,.. // . - 1994. - . 89. - . 2462-2478. Главный фактор, стимулирующий развитие атеросклероза, - повышенное содержание нативных и модифицированных липопротеинов низкой плотности (ЛНП) в плазме крови,приводящее к накоплению эфиров холестерина в макрофагах и к инфильтрации сосудистой стенки липопротеидами, связывающимися с белками и глюкозаминогликанами межклеточного матрикса.-// . . . . 1999. - . 340. - . 115-126. Только модифицированные ЛНП и/или их агрегаты проникают из крови в субэндотелиальную интиму,/ , ,.. // .. - 1993. - . 69. - . 377-781. В настоящее время применяется следующая программа диагностики атеросклероза лабораторная оценка нарушений жирового обмена анализы холестерина и липидного профиля, диагностика перекисного окисления липидов электрокардиография с проведением фармакологических и нагрузочных проб ЭХО-кардиография ультразвуковое ангиосканирование сосудов магнитно-резонансная и рентгеновская ангиография вспомогательные методы доплерометрия, доплерография, реовазография и др. Золотым стандартом верификации атеросклероза является ангиография. К недостаткам этого метода следует отнести инвазивность и невозможность его использования при скринирующих обследованиях, а также то, что этот метод позволяет оценить уже значимые повреждения стенки сосуда. Для ранних атеросклеротических изменений характерны следующие процессы в интиме активизируется фагоцитоз, в результате чего ослабляются межклеточные связи, а ЛНП (минуя регулируемый рецепторный путь захвата липопротеидов) проникают в клетку, вызывая накопление липидов в клетках.// . - 1993. - . 27(7). - . 1184-1190. Это, в свою очередь, ведет к стимуляции пролиферации, синтеза и секреции внеклеточного матрикса и дальнейшему накоплению внутриклеточных липидов. Эти процессы происходят с участием цитокинов, секретируемых лимфоцитами периферической крови, стимулирующих экспрессию генов, регулирующих синтез матрикса в атеросклеротических бляшках. У людей без признаков атеросклеротического поражения сосудов эндотелий артерий устойчив к адгезии лейкоцитов, даже при воспалительных процессах в тканях реологические параметры кровотока таковы, что местом скопления лейкоцитов являются посткапилляры и венулы, но не артерии//.. . - 1989. - . 15. - . 237-239. Наиболее близким по технической сущности является Способ диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия Патент Российской Федерации 2127429 1,2 13995 1 2011.02.28 1999, заключающийся в том, что при помощи количественного морфоденситометрического исследования изменений интерфазного хроматина ядер железистых клеток эндометрия осуществлялась диагностика гиперпластических процессов и рака эндометрия. Однако, в отличие от данного способа, в предлагаемом способе в качестве объекта была использована периферическая кровь, другие параметры хроматина и другая функция. Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение точности диагностики начальных стадий атеросклероза. Задача решается следующим образом из венозной крови готовят мазок, фиксируют его смесью Никифорова, обрабатывают рибонуклеазой, окрашивают галлоцианин-хромовыми квасцами, заключают в канадский бальзам и проводят микроденситометрию интерфазного хроматина ядер лимфоцитов, после чего рассчитывают дискриминантную функцию ДФ по формуле ДФ- 47,58(2)432,81(2) - 17,021569,29 - 6624,28,где (2) - значение площади окологранулярного интерфазного хроматина(2) - значение оптической плотности окологранулярного интерфазного хроматина- значение оптической плотности ядра,и при ДФ меньше 7500 диагностируют атеросклероз, а при ДФ больше 7500 - отсутствие поражения магистральных артерий. Предварительно на обучающих выборках для различных групп больных ИБС (35 больных) были установлены наиболее информативные показатели структуры интерфазного хроматина площадь окологранулярного интерфазного хроматина 4,16 оптическая плотность окологранулярного интерфазного хроматина 8,80 площадь ядра 65,00 оптическая плотность ядра 8,25. Формула для расчета параметров ДФ получена применением линейного дискриминантного анализа при помощи стандартного пакета статистических программ Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ. - . МедиаСфера, 2002. - 312 с Способ осуществляется следующим образом в качестве материала берут кровь при венопункции кубитальной вены и делают мазки на предметном стекле. Затем мазок фиксируют смесью Никифорова (этанол и эфир в соотношении 1 1) в течение 20 минут, высушивают на воздухе. Проводят рибонуклеазную обработку (рибонуклеаза разводится в осмолярном растворе сахарозы в концентрации 200 МЕ/100 мл). Обработка длится 60 минут при температуре 37 С, после чего мазок промывают в 3-х сменах дистиллированной воды. Окраску производят в растворе галлоцианин-хромовых квасцов Пирс Э. Гистохимия. - М., 1962. - 746 с После окраски препарат заключается в канадский бальзам и проводится микроденситометрическое исследование на системе анализа изображений. Результатом микроденситометрии являются оптические и морфометрические характеристики гетерохроматина и хроматина ядра. Процедура исследования одного мазка занимает 30-40 минут и более. Предлагаемый способ демонстрируют следующие клинические примеры. Пример 1 Больной Г., 54 года,истории болезни 33/17, БелНИИ ЭПП. Поступил в клинику с жалобами на головную боль в виде тяжести, боли в правом колене. Клинический диагноз ишемическая болезнь сердца (ИБС), атеросклероз аорты. Во время обследования и лечения в клинике предлагаемым способом был исследован хроматин интерфазных ядер лимфоцитов. Показатели структуры хроматина для обследованного больного площадь окологранулярного интерфазного хроматина 10,56 оптическая плотность окологранулярного интерфазного хроматина 8,00 3 13995 1 2011.02.28 площадь ядра 77,60 оптическая плотность ядра 7,36. Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель ДФ, равный 6565,44. Значение показателя ДФ меньше 7500, следовательно, у больного выявлены изменения структуры интерфазного хроматина, соответствующие атеросклерозу и ишемической болезни сердца, что полностью совпадает с данными клинических и лабораторных исследований. Пример 2 Больной К., 42 года,истории болезни 1502/780, БелНИИ ЭПП. Поступил в клинику с жалобами на боли в затылочной области и колющие боли в области сердца при повышении АД. Клинический диагноз артериальная гипертензиястепени, риск 2. ИБС. Атеросклероз аорты. С помощью предложенного способа исследовалась структура хроматина интерфазных ядер лимфоцитов (пример 1). Показатели структуры хроматина для обследованного больного площадь окологранулярного интерфазного хроматина 5,93 оптическая плотность окологранулярного интерфазного хроматина 8, 20 площадь ядра 72,00 оптическая плотность ядра 7,20. Рассчитан показатель ДФ, который равен 6716,412. Значение показателя ДФ меньше 7500, следовательно, у больного выявлены изменения структуры интерфазного хроматина, соответствующие атеросклерозу и ишемической болезни сердца, что подтверждено инструментальными и клинико-лабораторными исследованиями. Пример 3 Больной Г., 52 лет,истории болезни 6059/2880, БелНИИ ЭПП. Поступил в клинику с жалобами на подъем АД, боли в области сердца сжимающего характера с иррадиацией в левую руку, левую лопатку. Клинический диагноз ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения ФК-2, атеросклероз аорты 1. Симптоматическая артериальная гипертензия. С помощью предложенного способа исследовалась структура хроматина интерфазных ядер лимфоцитов (пример 1) площадь окологранулярного интерфазного хроматина 9,95 оптическая плотность окологранулярного интерфазного хроматина 8,75 площадь ядра 70,60 оптическая плотность ядра 7,16. Рассчитанный показатель ДФ был равен 6724,379. Значение показателя ДФ меньше 7500, следовательно, у больного выявлены изменения структуры интерфазного хроматина, соответствующие атеросклерозу и ишемической болезни сердца, что полностью совпадает с данными клинических и лабораторных исследований. Пример 4 Здоровый доброволец П. Признаки атеросклеротического поражения магистральных артерий отсутствуют. Хронических заболеваний в стадии декомпенсации нет. С помощью предложенного способа исследовалась структура интерфазного хроматина лимфоцитов периферической крсвп (пример 1) площадь окологранулярного интерфазного хроматина 4,16 оптическая плотность окологранулярного интерфазного хроматина 8,80 площадь ядра 65,00 оптическая плотность ядра 8,25. Рассчитанный показатель ДФ был равен 8827,095. Значение показателя ДФ больше 7500, следовательно, у здорового добровольца выявлены изменения структуры интерфазного хроматина, соответствующие пациенту без видимых поражений магистральных артерий. 4 13995 1 2011.02.28 Пример 5 Здоровый доброволец А. Признаки атеросклеротического поражения магистральных артерий отсутствуют. Хронических заболеваний в стадии декомпенсации нет. С помощью предложенного способа исследовалась структура интерфазного хроматина лимфоцитов периферической крови (пример 1) площадь окологранулярного интерфазного хроматина 2,94 оптическая плотность окологранулярного интерфазного хроматина 8,40 площадь ядра 66,40 оптическая плотность ядра 8,45. Рассчитанный показатель ДФ был равен 9002,149. Значение показателя ДФ больше 7500, следовательно, у здорового добровольца выявлены изменения структуры интерфазного хроматина, соответствующие пациенту без видимых поражений магистральных артерий. Совпадение результатов проведенных тестов с помощью предложенного способа и клинико-лабораторных исследований свидетельствует о специфичности способа диагностики ранних стадий атеросклероза. Таким образом, по сравнению с существующими методами предложенный способ диагностики атеросклероза позволяет широко использовать данный способ в практической медицине при обследовании больших групп населения,обеспечивая хорошую воспроизводимость результатов диагностического анализа за счет микроанатомирования препарата крови повысить точность диагностики начальных стадий атеросклероза. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5