Способ получения штамма thy А? Vibrio cholerae

(71) Заявитель Актив Биотех АБ(72) Авторы КАРЛИН Нильс ЛАБЕНС Михаэль Р.(73) Патентообладатель Актив Биотех АБ(57) 1. Способ получения штамма, включающий этап сайт-направленного мутагенеза в хромосомес целью делеции локуса гена , имеющего преимущественно нуклеотидную последовательность 1 или инсерции генных нуклеотидов в локус генаили инсерции генных нуклеотидов в локус генаи делеции части генных нуклеотидов и части локуса гена . 2. Нуклеотидная последовательность гена, представляющая последовательность 1. 3. Нуклеотидная последовательность 5 - фланкирующей области структурного гена, представляющая последовательность 2. 4. Нуклеотидная последовательность 3 - фланкирующей области структурного гена, представляющая последовательность 3. Изобретение относится к способу получения штаммов.частности, изобретение касается штамма, из хромосомы которого удален ген, т.е. штамма , в котором отсутствует функциональность гена . Данный штамм может содержать один или более эписомных автономно реплицирующихся элементов ДНК, таких как плазмиды, включающих факультативно чужеродный, например,., функциональный ген , обеспечивающий рост штамма в отсутствие тимина в питательной среде, а также факультативно - структурный ген, кодирующий гомологичный или гетерологичный белок. Кроме того, задачей изобретения являются нуклеотидные последовательности . Предшествующий уровень техники Экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных клетках-хозяевах чаще всего достигается путем интродукции эписомных самореплицирующихся элементов (например,плазмид), кодирующих структурный ген интересующего белка под контролем подходящего промотора, в хозяйские бактерии. Такие плазмиды обычно закрепляются путем введения селективных маркерных генов, которые кодируют белки, реализующие устойчивость 7652 1 2005.12.30 к специфичным антибиотикам (таким как ампициллин, хлорамфеникол, канамицин, тетрациклин и т.п.). Таким образом, их удерживают в хозяине путем добавления подходящего антибиотика в культуральную среду. Для стабильного закрепления плазмид в хозяйских штаммах часто требуется добавлять антибиотики определенной селекции, в отсутствие которых плазмиды могут расщепляться, образуя значительное число клеток такой культуры, в которой плазмиды отсутствуют, и которые, следовательно, не могут экспрессировать желаемый продукт. Однако применение антибиотиков для продуцирования рекомбинантных белков нежелательно в силу ряда причин. Помимо очевидного роста затрат, связанных с необходимостью добавлять антибиотики в питательную среду, их применение считается проблематичным при продуцировании любого рекомбинантного белка, предназначаемого для потребления человеком или животными. Это вызвано прежде всего тремя причинами. Вопервых, остаточные антибиотики могут вызывать у чувствительных людей серьезные аллергические реакции. Во-вторых, у тех, кто потребляет продукт, возможен отбор бактерий, устойчивых к антибиотикам, в естественной среде, и, наконец, ДНК, кодирующая устойчивость к антибиотикам, может также переноситься на бактерии, чувствительные к антибиотикам, тех людей, которые потребляют продукт, тем самым распространяя нежелательную устойчивость к антибиотикам в популяции. Уже заявлены изобретения, направленные на решение этой проблемы. Целью одного из таких изобретений является -ген, эффективно убивающий все клетки, которые не сохраняют копию плазмиды после каждого деления клетки 1. Еще одно изобретение 2, имеющее отношение к настоящему изобретению, основано на определении последовательности ДНКв Авторы интродуцировали генв плазмиду, используя при этом хозяйские штаммы, являющиеся спонтанными мутантами , которые отбирали на основании устойчивости к триметоприму. Такие мутанты хорошо не определены (несут точковые мутации и небольшие делеции). Они могут реверсировать к дикому типу (например, ) с такой высокой частотой, которая нежелательна. Это может приводить к тому, что хозяйские бактерии будут элиминировать плазмиду и тем самым прекращать продуцирование желаемого рекомбинантного продукта, или же это продуцирование будет непостоянным и ненадежным. Кроме того, селекция в пользу триметоприма может приводить к тому, что в результате будет возникать тиминзависимость, как следствие мутации гена дигидрофолатредуктазы (А) и, таким образом,не будет комплементироваться геном , рожденным в плазмиде 3. Рассмотрение этого изобретения прекращено, по крайней мере, в Европе. Установлено, что использование . для экспрессии рекомбинантных генов предпочтительнее использования других широко используемых прокариотических экспрессионных систем в силу того, что специфичные рекомбинантные продукты можно продуцировать в значительных количествах и секретировать в культуральную среду, облегчая тем самым последующую процедуру очистки. Наоборот, в случае использования . продукт часто аккумулируется в периплазматическом пространстве 4. Одним из важных факторов, придающим . такое свойство, являются -гены в . 5. Тимидилатсинтаза, кодируемая геноми других бактерий, катализирует метилирование дезоксиуридилатадо дезокситимидилатаи является основным ферментом биосинтеза дезоксириботимидинтрифосфатас целью инкорпорации в ДНК. В отсутствие этого фермента бактерии становятся зависимыми от внешнего источника тимина, который инкорпорируется вчерез утилизационный путь, кодируемый -генами 6. Спонтанные мутанты -- могут быть легко изолированы на основании устойчивости к триметоприму. Этот антибиотик ингибирует регенерацию тетрагидрофолата из дигидрофолата, продуцируемого в результате синтеза , катализируемого тимидилатсинтазой. Таким образом, если клетки - это , то они становятся тимин-зависимыми,но более не исчерпывают пул тетрагидрофолата в присутствии триметоприма. 2 7652 1 2005.12.30 Раскрытие заявленного изобретения Данное изобретение, в его различных аспектах, основывается на новой нуклеотидной последовательности генав. Генможет с успехом применяться,например, для закрепления плазмид, участвующих в сверхпродукции рекомбинантных белков в ., а также в последовательности для селективной и сайт-специфической инсерции чужеродных генов в хромосому Один из аспектов изобретения относится к способу получения штамма, который включает этап сайт-направленного мутагенеза в хромосомес целью делеции локуса гена , имеющего преимущественно нуклеотидную последовательностьили инсерции генных нуклеотидов в локус генаили инсерции генных нуклеотидов в локус генаи делеции части генных нуклеотидов и части локуса гена . Выражение имеющий преимущественно нуклеотидную последовательность, употребляемое в данном описании и в формуле изобретения, означает нуклеотидные последовательности, содержащие естественные или искусственные удлинения, удаления, делеции или добавления нуклеотидов, которые не препятствуют естественной функции интересующей нуклеотидной последовательности. Другой аспект изобретения относится к нуклетидной последовательности гена, представляющей последовательность, представленную на фиг. 1. Третий аспект изобретения относится к нуклеотидной последовательности 5-фланкирующей области структурного гена, представляющей последовательность 2, представленную на фиг. 2. Четвертый аспект изобретения относится к нуклеотидной последовательности 3 фланкирующей области структурного гена, представляющей последовательность 3, представленную на фиг. 3. Нуклеотидная последовательность 1 пригодна для селективной или сайтспецифической инсерции чужеродных генов в хромосому . , а также для сайтнаправленного мутагенеза с целью получения штаммов. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность. На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность 2 5-фланкирующей области структурного гена. На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность 3 3-фланкирующей области структурного гена. На фиг. 4 показано клонирование Есо/-фратиепта, содержащего ген. в 19. На фиг. 5 показано сравнение продуктов генаиз . 16, . и. 17, свидетельствующее о высоком уровне гомологии между . и. в отличие от На фиг. 6 показана инсерция генного блока -устойчивости в -сайт гена. в 19. На фиг. 7 показана генерация методом ПЦР фрагмента - с -концами. На фиг. 8 показано лигирование фрагмента - с -концами к плазмиде 705. На фиг. 9 изображена частичная делеция генаи старт -гена в 193. На фиг. 10 показано -расщепление для эксцизии генаиз 193, лигирование к 4, из которой выщеплен Ха. На фиг. 11 показана схема стратегии полной делеции генаиз 3 7652 1 2005.12.30 На фиг. 12 представлена инсерция 5-участка вверх (апстрим) от генав рМТ генерация рМТ с 5 прайм. На фиг. 13 представлена инсерция 3-участка вниз (даунстрим) отв рМТ с 5 прайм генерация рМТ На фиг. 14 показан экспрессионный вектор -, используемый для экспрессиив . 1569 . На фиг. 15 показан экспрессионный вектор -, используемый для экспрессиив . 1569 . Описание экспериментов Применяемая стратегия Для получения мутантов. с заданными свойствами, которые можно было бы использовать в качестве штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, кодируемых на плазмидах, закрепляемых -комплементацией, сначала было необходимо провести клонирование и дать определение гена дикого типа и его 5- и 3-фланкирующих областей. Стратегия заключалась в первоначальном клонировании гена. на плазмиде на основании комплементации -аутотрофа в штамме . 12. Были проведены рестрикционный анализ и эксперименты по субклонированию с целью локализации структурного гена на первоначально полученном крупном фрагменте ДНК. Затем проводили секвенирование соответствующего участка, содержащего гени его 5-и 3 фланкирующие области. Чтобы проверить, что один из секвенированных генов действительно является геномиз ., проводили сравнение уровня гомологии с последовательностямииз других организмов. Клонированный ген был также способен комплементироваться с фенотипоммутантного штамма ., выделенного на основании устойчивости к триметоприму. Секвенционный анализ этого мутанта показал, что он действительно имел единственную замену основания в гене, который был определен как ген , в результате чего образовался стоп-кодон, дающий продукт нефункционального урезанного гена. Определение последовательности , а также последовательности окружающего его участка, позволило применить подходящие суицидальные векторы для сайт-направленного мутагенеза. Были рассмотрены стратегии, состоящие в а) инсерционной инактивации б) сочетании инсерционной инактивации и генной делеции и в) полном исключении гена. а) Инсерционную инактивацию генапроводили путем инсерции генного блока(с суицидальным вектором 705 14). б) В штамме, несущем генный блок , проводили делецию приблизительно 400 п.о., что приводило к утрате 200 п.о из генавверх(апстрим) от инсерционного сайта и 200 п.о. из гена устойчивости к канамицину, который таким образом инактивировался. В результате получали делеционный ген , в котором была утрачена центральная часть, а затем осуществляли инсерцию некодирующего участка ДНК. Эту конструкцию вставляли в хромосому . с помощью суицидального вектора 4 и получали штамм, который был назван 1569. в) Полное удаление генаосуществляли путем лигирования областей, фланкирующих структурный ген так, чтобы при этом не разорвать другие открытые рамки считывания (разрыв -гена также является летальным). ДНК, несущую делецию, клонировали в новый суицидальный вектор (рМТ), который использовали для инсерции последовательности в хромосому Полученный в результате штамм назвали 1569. Для экспрессии рекомбинантных генов в этих штаммах. конструировали два экспрессионных вектора. Каждый включал гениз ., ориджин репликации универсального высококопийного вектора 19, -промотор и -независимый терминатор транскрипции. В один из двух векторов вставляли -ген для регуляции экспрессии из -промотора, который также содержал последовательность -оператора. 4 7652 1 2005.12.30 Оба гена клонировали в этих плазмидах и экспрессировали во вновь генерированный штамм .1569, в котором утрачен ген . Первый ген кодировал Всубъединицу термолабильного энтеротоксина человека из .(фиг. 14), второй был 26 кД глутатионтрансферазаиз- (фиг. 15).имеет структуру, сходную со структурой В-субъединицы холерного токсина,продуцируемого естественным образом штаммом-хозяином. Его секретировали в питательную среду. Другой белок имеет эукариотическое происхождение от азиатского печеночного двуустка. Как известно, 26 кДэкспрессирует в больших количествах в . и аккумулируется в цитоплазме. Экспрессию двух рекомбинантных белков оценивали на основании 1- иммунодетекции с применением связанной формы ферментов культурального супернатанта в случаеи на основании коммерческих материалов для исследования в случае . Оба белка также анализировали методами электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН и Вестерн-блоттинга. Происхождение генаГенклонировали из штамма . 1569. Данный штамм происходит из штамма 569 В Инаба . классического биотипа (,. 25870). Штамм имеет делецию в гене 7 и обеспечен устойчивостью к рифампицину 8. Клонирование 1,4 кб /-фрагмента, содержащего ген. Хромосомную ДНК, приготовленную методом ЦТАБ 9, полностью расщепляли посредством рестриктазы . Расщепленную ДНК лигировали в универсальную векторную плазмиду 322 (. ,США), которую расщепили с помощьюи обработали щелочной фосфатазой. Смесь, полученную в результате лигирования, электропорировали 10 в штамм . 101, фенотипически представляющий собой(селекцию проводили на основании устойчивости к триметоприму), культуру рассевали на пластинках агара, содержащих модифицированную синказу 11 с добавлением 50 г/мл ампициллина, но не содержащие тимин. Трансформанты выделяли как на основании плазмидной восприимчивости, так и на основании присутствия функционального гена . Колонии засевали штрихом отдельными колониями на пластинки агара того же типа,затем растили в питательном бульонес добавлением ампициллина. Плазмидную ДНК готовили, используя( ..), и расщепляли с помощью . Выделяли фрагмент размером около 10-12 кб. Этот клон был назван 2. Чтобы сократить размер фрагмента, плазмиду разрезали посредством Есо и повторно лигировали с помощью Т 4-лигазы. Лигированную ДНК снова электропорировали в штамм., описанный выше, используя те же селективные условия для роста трансформантов. Колонии, получаемые в результате этого эксперимента, изолировали, как описано выше, плазмидную ДНК очищали и анализировали методом двукратного расщепления с помощью Есо и . Оставался фрагмент ДНК размером приблизительно 1,4 кб, который сохранял способность комплементировать мутациюв штамме-хозяине Этот фрагмент клонировали в плазмиду 19 , которую расщепляли теми же двумя ферментами и обрабатывали щелочной фосфатазой. После электропорации трансформанты, получаемые в ходе эксперимента, выделяли и характеризовали, как описано выше. Этот клон был назван 12 (фиг. 4). Проверка содержания генав 1,4 кб /-фрагменте. Анализ методом Саузерн блоттинга. Чтобы убедиться в том, что клонированный фрагмент действительно имел . хромосомное происхождение, ДНК штамма 1569 полностью расщепляли с помощьюи Есо и . Фрагменты ДНК разделяли по размеру методом электрофореза в агарозном геле вместе с клоном 2, полученным при расщеплении с помощью , и клоном 12, полученным при расщеплении с помощью Есо и . 5 7652 1 2005.12.30 После электрофореза ДНК переносили на нейлоновую мембрану, иммобилизировали путем УФ облучения и гибридизировали (в жестких условиях) с фрагментом 1,5 кб, удаленным из клона 12, меченным 32 дСТФ из набора. Обсуждение результатов. Как в хромосомной ДНК, расщепленной с помощью, так и в клонеВ 2, расщепленном с помощью , была выделена полоса длиной прибл. 10 кб. Полоса длиной 1,4 кб была выявлена и в хромосомной ДНК и клоне 12 плазмидной ДНК, расщепленных с помощью Есо и(данные не приводятся). Это свидетельствовало о том, что клонированный фрагмент был получен из ДНК. 1569. Трансформация 1569 с участием плазмиды 12. Чтобы проверить, что клонированный Есо/-фрагмент размером 1,4 кб мог поддерживать рост фенотипически., тимин-зависимый мутант 1569(. 1569 4.4) электропорировали в плазмиду 12. Электропорация и селективные среды были такие же, как описано выше. 1569 4.4 не рос на МС-среде без добавления тимина. Обсуждение результатов. Изолировали колонии 1569 4.4, выросшие в отсутствие тимина. Было обнаружено, что все они заякорили плазмиду 12, что, таким образом,подтверждало предположение о том, что клонированный фрагмент содержал гениз Секвенирование ДНК плазмиды 12. Плазмидную ДНК секвенировали методом терминации дидезокси цепочки 12 с использованием набора для секвенирования( ). Использовали как коммерческие, так и изготовленные на заказ праймеры. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе марки 373 ( ). Данные анализировали с применением программного обеспечения( ). Гомологию с обнаруженной последовательностью ДНК устанавливали с помощью программы 13. Обсуждение результатов. Самая значительная гомология была проявлена с тимидилат синтетазами из различных видов. Следует отметить, что гомология с тимидилат синтетазой . оказалась незначительной (фиг. 5). Стратегия делеции генав . 1569. Для получения определенных мутантов. 1569 применяли две разные стратегии. Первая состояла в инактивации генапутем инсерции генного блокаи последующей частичной делеции генаи генного блока . Вторая стратегия была основана на полной делеции генаиз хромосомы посредством нового суицидального вектора рМТ -. Данный вектор содержит 5- и 3-фланкирующие области гена , а также 6-ориджин репликации и 4 -гены. Для переноса генаиз штамма 1569 было решено использовать уже тиминзависимый 1569 4.4, так как предварительные эксперименты показали, что имеются серьезные селективные недостатки в переходе от дикого типа к тимин-зависимости даже в присутствии значительных количеств экзогенного тимина. Инактивация генапутем инсерции генного блокаСтратегия состояла в инактивации генапутем инсерции гена устойчивости к канамицину в уникальный -сайт генав виде генного блока(фиг. 6). Эту конструкцию амплифицировали методом ПЦР (ПЦР система марки,) с праймерами, содержащими -концы, таким образом, чтобы ее можно было перенести в суицидальную плазмиду 705 14, несущую уникальный -сайт и ген устойчивости к хлорамфениколу. Для инсерционно инактивированного гена использовали следующие праймеры-11 5 СТАСТА 3 соответствующий основаниям 235-257 в 2 (фиг. 3) с добавлением -сайта (выделен жирным шрифтом) (фиг. 79). Полученную в результате плазмиду затем переносили в . -17, который применяли в экспериментах по конъюгации. Поскольку штамм-реципиент 1569 4.4 устойчив к рифампицину и чувствителен к хлорамфениколу, а штамм-донор . -17 устойчив как к хлорамфениколу, так и к канамицину, трансконъюганты отбирали путем селекции на устойчивость как к рифампицину, так и к канамицину. Однако получаемые в результате штаммы . будут также устойчивыми и к хлорамфениколу, так как изначально в хромосому будет включаться полная плазмида. Затем можно было отбирать экзоконъюганты, инкорпорировавшие инактивированный ген, несущий генный блокв хромосому, и утратившие плазмиду 705, из тех, что были чувствительными к хлорамфениколу, но оставались устойчивыми к канамицину. Чтобы проверить инсерцию гена канамицин-устойчивости в ген , полный генамплифицировали методом ПЦР с помощью праймеров -10 и -11. Размер полученного в результате фрагмента сравнивали с размером нативного гена . Был обнаружен предполагаемый фрагмент генаразмером 2,6 кб против 1,4 кб нативного гена . Обсуждение результатов. Экзоконъюганты проявляли устойчивость к канамицину,чувствительность к хлорамфениколу, а после амплификации посредством ПЦР обнаруживали инкорпорацию в хромосому генного блока канамицин-устойчивости. Секвенирование амплифицированного фрагмента показало, что единственный дефект в гене был вызван инсерцией гена устойчивости к канамицину. Это свидетельствовало о том, что процесс рекомбинации вызвавший инкорпорацию инсерционно инактивированного гена в хромосому, также вызывал элиминацию точковой мутации, которая делала штаммреципиент (1569 4.4) тимин-зависимым. Рост получаемого в результате штамма наблюдался только в том случае, если в питательную среду добавляли тимин (200 г/мл). Частичная делеция генаи генного блокаДля большего обеспечения нереверсивности мутации генаинсерционно инактивированныйсубклонировали как -фрагмент в 193 . Конструировали ПЦР-праймеры, вызывающие утрату 209 пар оснований из генаи 261 пару оснований из генного блока . Генеще раз дисруптировали и таким образом инактивировали ген устойчивости к канамицину (путем устранения старта кодирующего участка). Общим результатом этого был штамм, несущий делегированный ген , содержащий также инсерцию некодирующей ДНК.-1553 Выделенные жирным шрифтом буквы означают -сайты расщепления (фиг. 9). После ПЦР-амплификации получали фрагмент ДНК, содержащий полную плазмиду,за исключением делетированного участка. Амплифицированную ДНК расщепляли посредством , самолигировали и трансформировали в . 101. Отбирали колонии на пластинках, содержащих ампициллин. Производили отбор отдельных колоний и делали пересев штрихом. Анализ с помощью рестриктаз , ,ипоказал, что небольшие плазмидные препараты из отдельных колоний давали ожидаемый тип рестрикций. Неполный ген , несущий инактивированный ген устойчивости к канамицину, вырезали из вектора расщеплением с помощью , очищали и лигировали в 4 15(фиг. 10). 4 - это суицидальный вектор, полученный из 705, содержащей ген изи модифицированный сайт множественного клонирования. 7 7652 1 2005.12.30 После переноса 4 -плазмиды в штамм . -17 проводили эксперимент по трансконъгации. В этот раз штамм . 1569 , полученный как указано выше, использовали в качестве штамма-реципиента. Спаривание оснований проводили, как описано выше, с отбором по рифампицину и хлорамфениколу. После роста в этой среде колонии выделяли на среде, содержащей 10 ную сахарозу в отсутствие хлорамфеникола. Сахароза индуцирует -ген, кодирующий левансахарозу, которая преобразует сахарозу в леван. Это соединение является токсичным для многих грамотрицательных организмов. Поэтому клоны, все еще несущие суицидальную плазмиду, убивали, оставляя экзоконъюганты, утратившие плазмиду. Обсуждение результатов. Выделяли колонию, чувствительную к хлорамфениколу и канамицину. ПЦР-амплификация -участка с помощью праймеров -10 и -11 подтвердила, что -фрагмент (2,6 кб) на хромосоме был замещен -фрагментом (2,1 кб). Рост получаемого в результате штамма наблюдался только в том случае, когда в питательную среду добавляли тимин (200 г/мл). Этот штамм был назван . 1569. Прямая делеция генав Данный подход заключался в применении последовательностей 5- и 3-фланкирующих областей гена . Конструировали новый суицидальный вектор - рМТ -1(фиг. 12), содержавший 6-ориджин репликации, -гены из 4, ген устойчивости к хлорамфениколу и сайт множественного клонирования из 28 (). Эффективно конструировали модифицированный фрагмент, в котором кодирующий участок заменяли сайтом множественного клонирования (полученным из 28), оставляя только 5- и 3-область -локуса из Полученную в результате плазмиду использовали для генерации штамма ., в котором был утрачен полный ген . В качестве исходного материала для такой конструкции использовали плазмиду рМТ-34 53 соответствующий комплементарной последовательности оснований 815-832 в 2 с присоединенным к ней-сайтом (выделен жирным шрифтом). Эта пара праймеров дает фрагмент ПЦР длиной 743 основания, соответствующий 5 фланкирующей области гена .-32 53 соответствующий комплементарной последовательности оснований 731-749 в 3 с -сайтом (выделен жирным шрифтом). Эта пара оснований дает фрагмент ПЦР длиной 746 оснований, соответствующий 3 фланкирующей области гена . В качестве матрицы для реакций ПЦР использовали препарат хромосомной ДНК из. 1569 (фиг. 11). Амплифицированную ДНК расщепляли подходящими рестриктазами и клонировали в вектор - 1 (фиг. 12 и 13), получая -плазмиду ., содержа 8 7652 1 2005.12.30 щую приблизительно 700 пар оснований 5-области вверх от генаи такое же количество пар оснований 3-области вниз от гена . Эту плазмиду переносили в . -17 и использовали в экспериментах по конъюгации, как описано выше. В качестве реципиента использовали штамм . 1569 4.4. Спаривание оснований проводили на ЛБ-агаре с добавлением рифампицина, хлорамфеникола и тимина. Экзоконъюганты, утратившие суицидальную плазмиду в хромосоме, выделяли на основании чувствительности к хлорамфениколу. Обсуждение результатов. Выделяли колонию, чувствительную к хлорамфениколу и устойчивую к рифампицину. В результате ПЦР-амплификации -участка с помощью праймеров -10 и -11 получали фрагмент 1,4 кб из нативного генаи фрагмент 0,6 кб из гена . Это подтверждало, что структурный генна хромосоме был делетирован. Более того, бактерии могли расти только в среде с добавлением тимина. Этот штамм назван . 1569. Экспрессия В-субъединицы термолабильного энтеротоксина из .и 26 кД глутатионтрансферазыизв . 1569 . Конструировали два экспрессионных вектора, каждый из которых содержал гениз ., ориджин репликации высококопийного вектора 19, -промотор и независимый -терминатор транскрипции. В один из двух векторов вставляли -ген для регуляции экспрессии -промотора, который также содержал последовательность-оператора (фиг. 14 и 15). Экспрессия белкав штамме . 1569 Экспрессионный вектор, представленный на фиг. 14, электропорировали в . 1569. Трансформанты выделяли на МС-агаре. Растили отдельные колонии для продуцирования плазмидных минипрепаратов, которые исследовали посредством рестрикционного анализа. Для экспрессии растили трансформант на -среде при 37 С с перемешиванием культуры. На культуральной среде собирали урожай и проводили анализ на содержаниес помощью прибора марки 1-. Обсуждение результатов. Как показал анализ с помощью 1-, культура продуцировала приблизительно 300 г/мл . Методами электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН и Вестерн блоттинга с использованием -специфичного моноклонального антитела затем подтверждали, что секретируемый белок был . Экспрессия белкав штамме . 156926 кД глутатионтрансферазуизклонировали в экспрессионный вектор, показанный на фиг. 15. Этот вектор идентичен первому вектору, за исключением последовательности -гена. -ген обеспечивает контролируемую экспрессию рекомбинантных белков. Вектор электропорировали в . 1569. Трансформанты выделяли на МС-агаре. Растили отдельные колонии для продуцирования плазмидных минипрепаратов, которые исследовали посредством рестрикционного анализа. Для экспрессии растили трансформант на МС-среде при 37 С с перемешиванием культуры и добавлением ИПТГ. Обсуждение результатов. В цитоплазме . бактерий был обнаружен рекомбинантный белок. Методами электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН и Вестерн блоттинга с использованием -специфичного моноклонального антитела( , Упсала) подтверждали, что был экспрессирован . Уровень экспрессиибыло труднее определить, чем уровень , поскольку белок экспрессировался межклеточно, но по предположению он должен быть в тех же пределах, что и . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.