Способ удаления эндотоксина из культуральной жидкости штамма фазы I Bordetella pertussis

Настоящее изобретение относится к способу удаления эндотоксина пертузиса. токсонду пертузиса и способу его получения.Пертузис представляет собой заразное инфекционное заболевание, называемое ВотоетеПа рек-шведа, протекающее особенно тяжело у младенцев и детей младшего возраста.Для предотвращения этого заболевания до НЭСТОЯЩСТО ВРЕМЕНИ ИСПОЛЬЗОВВЛИ ВЕЦСЦИНЫ. Однако любая вакцина, полученная с использованием всего микроорганизма Врепиазйз,дает интенсивные побочные реакции, например, тат-сие как лихорадка, и для преодоления такого недостатка была разработана и используется бесклеточная пертузисная вакцина(вагщина АСР), практически Не содержащая эндотоксина (ЕТ), который, главным образом, ответственен за возникновение шишорадки и других побочных реакций, полученная путем выделения антшкгнфицирутощей фракции, например такой, как нигевой гемагтпотинин (РНА), токсин пертузиса (РТ) и фибрин.Решающей стадией получения АСР вакшаиы является отделение эндотоксина (ЕТ) от анттшттфекционной фратщии и обычно для этой цели применяют метод сахароза-градиентното центрифугирования 1.Кроме этого, в качестве метода удаления пирогена известен способ с использованием кальций фосфатного геля 2. Известно также,что гидроксилалатитный гель, стабилизированный вариант кальций фосфатного геля,является эффекгивньщ средством для отделеьшя нитевидното гематлютинина (РНА) от токсина пертузиса (РТ) и что практически не содержащий эндогоксина нитевидный гемаглтоггинин может бьтть отделен от токсина пертузиса хроматографией на гидроксилапатитном геле и последующей очисткой хроматографией по сродству и сахарозаградиентным центрифугированием З.Только с помощью сахароза-градиентные центрифугирования можно удалить около 99,995 эндоксина (ЕТ), однако в том случае,когда хсидкость, содержащая сырую антиинфеютионнуто фракцию, обогащена эндотоксином (ЕТ), полное отделение защитной фракции от эндотоксина (ЕТ) затруднительно и выход антиинфегщионной фракции соответственно невысок. Кроме этого, поскольку производительность процесса невелика и операция является дорогостоящей и длительной, такой способ не является удовлетворительным для промьштленного использования.С другой стороны, простая обработка кальцтип 7 г фосфатным гелем обеспечивает невЬтсокую степень удаления эндоггоксина порядка 90-99,9 и, поэтому, непригодна для промь 1 шленного применения. На лабораторном уро 10вне можно отделить и очистить нитевидный гемагтлюггинша (РНА) до практически полного отсутствия эндотоксина при выделении из токсина пертузиса (РТ) путем комбинашш методов хроматографии на колонке с гидроксилапатитом, хроматографии по сродству и сахароза-Градиентт-гого центрифугирования,однако такой метод не обеспечивает производительности, приемлемой для промь 1 шленного использования. Кроме этого,рассмотренная технология объективно отличается от настоящего изобретения, которое направлено на удаление эндотоксина (ЕТ) из жидкости, содержащей запштнуто фракцию и эндотоксин (ЕТ).В отличие от описанного въпле уровня технитш, разработан эффективный способ удаления эндотоксшта (ЕТ) и обнаружено, что обработка кальшай фосфатным гелем, предшествующая сахароза-градиентному центрифугированию приводит в результате к чистому отделению залштной фракции от эндотоксина (ЕТ) и, кроме этого, обеспечивает усовершенствования как по производительности, так и по степени удаления эндотоксина (ЕТ) по сравнению с сахарозаградиентным центрифугированиемСогласно настоящему изобретению способ удаления эндотоксина из культуральной жидкости штамма фазы 1 ВогаетеПа регшввйв предусматривает отделение супернатанта культуральной жидкости, фракционирование его сульфатом аммония, растворение осадка в фосфатном буфере, содержащем ЫаС 1, отделение антигенсодернсащего супернатаьпа центрифугированием, обработку его сутпэфатом аммония, повторное растворение осадка втом же буфере, диализ полученной смеси с последующим центрифугированием диализата в градиенте плотности сахарозы в течение 10-24 час,причем такой способ характеризуется тем, что к антигенсодержащему супернатанту добавляют 0,01-0,1 милли-эгсв/ьш ионов кальшш в присутствии избытка ионов фосфора и вьгдерэтсивают при температуре 4-25 С в течение 0,3-4 час до образования О,О 1-0,1 миллизгсв/мл кальций фосфатного геля в качестве источника ионов калышя используют ацетат кальция или хлорид кальция, или нитрат кальция Центрифугирование осуществятся в градиенте плотности сахарозы от О до 30 масс при 60000-122000 3.Предложенный способ осуществляют следующим образом.Культуральная хсидкостъ, содержащая антиинфекционную фракцию и эндотоксин штаммов фазы 1 ВогаетеПа реггцзыв, может представлять собой, например, верхний слой культурного бульона, полученного при вь 1 рацшвании штаммов фазы 1 В. регшэзйв, или егоконцентрат, причем особенно предпочтительным является концентрат. Культурирование штаммов фазы 1 ВогаетеПа репцввйв может проводиться традиционным методом. Так,например, микроорганизмы выращивают в бульонной среде (например, в среде КохенВилера или Стайнер-Шолте) при температуре 35-37 С в течение 5-7 дней. Верхний слой полученного таким образом культурного бульона собирают, например, путем фильтрации или центрифугирования. Такой верхний слой может бьпъ непосредственно, или после концентрирования, подвергнут следующей стадии обработки с целью удаления эндотоксина. Концентрирование для этой цели может быть осуществлено путем использования известных рег ее методов высаливания. Так,например, 2-5 кг сульфата аммония добавляют к каждым 10 л верхнею культурного слоя и полученный в результате осадок собирают путем, например, фильтрации наш центрифугирования. Такой осадок затем растворяют в соответствующем количестве системы 1 М хлористого натрия - 0,05 М фосфатный буфер и полученный раствор центрифутирутот либо обрабатывают таким-либо еще способом с целью отделения верхнего надосадочното слоя.Удаление эндотоксина согласно настоящему изобретению заключается в том, что в жидкость, содержащую антиинфекционную фракцию и эндотоксин штаммов фазы 1 ВогбетеПа реппззйз вводят ионы кальция в присутствии избытка ионов фосфата, полученный в результате осадок отбрасывают и маточнуто жидкость подвергают зональному центрифугированию.Если в лсидкости отсутствуют ионы фосфата, то добавляют фосфатный буферный раствор, например, 0,05 М фосфатный буфер,дополненньцй 1 М хлористого натрия, и затем вводят ионы кальция. Поставщиком ионов кальция могут служить такие растворимые соли кальция, как ацетат кальция, хлористьпй кальций, нитрат кальция и т.п., а также такие нерастворимые соли кальция, как фосфат кальция и т.п. Особенно предпочтительными соединениями являются ацетат кальция и хлористый кальций. Отношение количества ионов фосфата к количеству ионов кальция составляет 1,25-З 0 эквивалентов, предпочтительно, 1,5-7,5 эквивалентов ионов фосфата к каждому эквиваленту ионов кальция и рекомендуется обеспечить такой ренсим, чтобы образовывалось 001-0,1 миллизквивалентов/мл, предпочтительно 0,02-0,7 тушллиэтозивалентов кальций фосфатного геля.Обычно используют следутцуто типовую методику. Предполагая, что осадок, полученный фракционным осаждением надосадочногослоя культурного бульона штаммов фазы 1 Воп 1 е 1 е 11 а регшевйз с использованием сульфата аммония, растворяется в смеси 1 М раствора хлористого натрия и 0,05 М фосфатного буфера, ацетат кальция добавляют до конечной концентрации 0,01-1,0 вес./об.,предпочтительно 0,2-0,6 вес/об., при рН 6,5-9 и полученной смеси дакгг постепенно реагировать в температурном интервале 4 С комнатная температура в течение времени от 20 минут до 2 часов с получением кальций фосфатного геля. После такой реакции полученный в результате осадок удаляют таким известным рег зе методом, как фильтрация или Центрифугирование. Согласно такой методике можно селективно удалить 90-99,9 эндотоксина без заметной потери защитной фракции.Полуочищенный продукт, полученный вьппе, далее подвергают зональному центрифугированию, предпочтительно, после допоштительного концентрирования выс аливанием с помощью сульфата аммония (фракционное осаждение).Метод зонального центрифугирования согласно изобретению может представлять собой сахароза-градиентное центрифугирование, калий фосфатное центрифугирование под действием силы тяжести, цезий хлоридное градиентное центрифугирование и т.п., хотя особенно предпочппедтьньш методом является сахароза-градиентное центрифугирование. Обычные условия сахароза-градиентные центрифугирования градиент плотности 0-30 масс. К шаха примерно 60000-122000 в время примерно 10-24 часа.В соответствии с настоящим изобретением,полученную таким образом жидкость, содержащую антиинфекционнуто фракцию пертузиса, подвергают детоксификации с помощью формальдегида, глугарового альдепща, пировиноградного альдегида и т.п., после чего избъпок формальдегида, глутарового альдегида, пировиноградного альдегида или т.п. удаляют такими рег зе известными методами,как диализ, Центрифугирование или ультрафильтрация и т.д. с получением токсоида пертузиса. Методика детоксификации заключается в добавлении формальдегида к пертузис зкзотоксин-содержащей зющкости в количестве 0,1-0 б об./об. при практическом отсутствии (т.е. не более 10 мМ) основных аминокислот (например, Е-лизина,глицина и т.п.), шткубировании смеси при температуре З 2-42 С в течение 3-14 дней с тем, чтобы вызвать флоккуляцию, разрушении выпавшего хлопьями токсоида с помощью подходящих средств (например,воздействием ультразвутш с частотой 10-15 шшоцшшов) и суспендировании его в соотве 7 ВУ 1265 С 1 втотвуюшей водной среде (например, М/100 М/250 фосфатном буферном растворе) с получением токсоидной хсидкости.нера-Шолте до конечной концентрации 1 миллиард клеток/мл и в склянке Рауха в течение 5 дней проводили инкубацию при З 5 С. Выросшие в культурном бульоне клетки со врезультате может быть получен токсоид пер- 5 бирали и в верхний слой добавляли 20 тузиса с содержанием эндотоксина, в расчете вес./об. сульфата атимония. После тщательна 10 мкг протеинового азота, не более 0,5 нт, ного перемешивания полученную смесь выпредпочштельно, не более 0,1 нг согласно стаивали при 4 С. Примерно через 14 дней лимулус лизатному тесту. Другими словами, смесь центрифугировали, верхний слой степень удаления эндотоксина может бьпь 10 отбрасывали и собирали осадок. Затем к таулучшена до значения не менее 999994, кому осадку добавляли 1/10 объема, в расчете идш, по крайней мере, 99,9998. на собранньпй раствор, смеси М хлористого Токсоид пертузиса согласно настоящему натрия и 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0) изобретению может быть превращен хорошо и полученную смесь тщательно перемешиизвестными методами в осажденную пергу- 15 вали и выстаивали при 4 С в течение 4 дней. зиснуто вакцину или осажденную пергузис- Затем смесь снова центрифутировали и собидифтерия-столбнячнуто тройную вакцину, ради верхний надосадочньтй слой (экстракт предназначенную для вакцинации людей. 1). Этот экстракт 1 обогащен зацгитной фракНа фиг.1 и 2 показаны профили сахароза- пней, содержащей нитевидньпй тематттпотиградиентного центрифугирования кальций 20 нин (РНА) и токсин перггузиса (РТ), а также фосфатной голевой группы и контрольной эндотоксин, но при этом не содержит клеток. группы соответственно. К аликвотам такою экстракта 1 постепенно Свойства штамма ВогбетеПа регшэзв Тохама добавляли ацетат кальция до конечных конфазы 1, используемого в следующих ниже центрацттй 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 вес./об. и примерах описаны, например, в йлгесттоп апа 25 каждую смесь осторожно перемешивали при Тптшцпйу 6,899 (1972). Такой штамм хранится комнатной температуре в течение 1 часа. Зав Национальном институте здоровья, Токио, тем полученный в результате осадок отфильтЯпония (ЪПНЗ) И депонирован также в Ин- ровывали с помощью фильтровальной бумаги ституте ферментации, Осака, Япония под ка- с образованием верхнею надосадочного слоя. телохшьш номером 1170 14073 от 13 августа 30 Используя каэкдьтй из полученных таким 1980 г. образом надосадочньтх слоев, определяли Справочный пример 1. титр темагглюгинтпта (РА), содержание РТ и Штамм Вогс 1 ете 11 а репивзтз Тохама фазы 1 содержание ЕТ. Полученные результаты(1130 14073)ино 1 улировали на среду Бордета- представлены в таблице 1. Содержание РТ Генгоу, приготовленную из картофеля, пе- 35 определяли методом ЕЫБА, асодержание ЕТ птона, хлористого натрия, агара И коровьей определяли лимулус-лизатньтм методом (накрови и инкубировали при З 5 С в течение 2 бор Маллинкродта), используя в качестве дней. Затем отбирали полупрозрачные круто- стандарта этщотоксин вдов (Цифко 055-В 5). вые колонии и одну из них, реагирутощую на Из таблицы 1 следует, что ВТ можно селеК агглютининовое антитело, снова распреде- 40 кгивно удалить путем введения в систему соли ляли на среде Бордет-Гентоу с целью приго- кальция в присутствтш избытка ионов фостовления посевной культуры. Затем такую фата и отделения полученного осадка. Более посевную культуру трансплантировали в бу- того, в результате добавления 0,2-06 вес/об. лъонную среду Коген-Вилера и систему ин- ацетата кальция мохшо удатптть около 99 кубировали в течение 1 дня при З 5 С. 45 ЕТ, не теряя при этом зацштной фракции (НА Полученную в результате бактериальную сус- титр и содержание РТ). пензню добавляли в бульонную среду СтайТаблнца 1 Коэшчество добав- Содержание Удаление Титр НА Содержание РТ ленного ацетата эндшоксина эндотоксина (НАи/мл) (Ей/мл) тшльштя вес. об. нг мл 0 87800 - 1200 1220 0,2 1043 98,2 1100 1140 0,4 960 98,9 1400 1400 0,6 720 99,2 1200 1080 0,8 78 99,9 400 1210 1,0 20 99,9 200 1030Титр НА преимущественно отражает содержание РНА.Повторяли ътетош/Пд писанную в примере 1, за исключением того, что рН устанавливали равным 5.0-10.0 с помощью пищроксида натрия или хлорнстоводородной кислоты, а количество добавленного ацетата кальцияСодержание эндоток сшта нг мл 2Повторяли методику, описанную в справочном примере 2, за исключением того, что вместо 0,5 вес/обацетата кальция использовали 5 вес/обтидроксилапатита (ВДН). Полученные результаты представлены в таб шще 3.рН Содержание эндоток- Удаление эндоток составпяло 0,5 вес./об. Полученные результаты представлены в таблице 2.Начиная со значения рН 6,0, происходило желатинирование, и степень удаления эндотоксина увеличивалась с повьплением значения рН. Из таблицы 2 следует, что оптимальное значение рН 7-9.Из таблпщьт 3 следует, что по сравнению с добавлением ацетата кальция для образования кальций фосфатных гелей внутри раствора, введение пшроксилапатита приводит к менее эффективному удалению эндотоксгша и обеспечивает обращение упомянутой вьлле зависимости от значений рН.Кансцьпй экстракт 1 (контрольная группа),полученный по методшсе, описанной в справочном примере 1, и материал, полученньпй добавлением ацетата кальция к экстракту 1 до конечной концентрации 0,5 вес/об. и последующей обработкой смеси согласно описанному в справочном примере 1, смешивали с равным объемом насыщенного водного раствора сульфата аммония и полученную смесь вътстатгшадш в течение семи дней при 4 С. Осажденный сульфатом материал центрифугироватш при скорости вращения 10000 об/миьт в течение 20 ъшнуг и собирали осадок. Затем добавляли 1/300 объема, в расчете на объем раствора смеси М хлористого натрия и 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0). После тщательного перемешивания смесь подвергали диализу в трубке с использованием в качествевнешней среды М раствора хлористого натрия (рН 8,0). Диализат подвергали сахароза-градиентному центрифугированию в следующих условиях градиент плотности сахарозы 1-30 масс/масс, Емакс. 69400 6 и время около 18 часов. Загрузка в случае группы кальций фосфатного желатинирования вдвое превьппала загрузку контрольной группы. После центрифугирования в ротор вводили 34 масс/масс раствора сахарозы с целью осуществления фракционного сбора. В каждой собранной тата/ш образом фракции определяли содержание РНА с помощью методики ЕЫЗА и содержание РТ и ЕТ с помощью метода, описанного в справочном примере 1. Полученные результаты на фиг. 1 и 2. На этих рисунках содержания РНА, РТ иЕТ обозначены сшдволаьш -О- -А-, и -.соответственно.