Способ получения человеческой MnO2-дисмутазы

сии. состоящего из промоторо АВН 1 ЕВ 11161/ЕВ 1 1164 ЕВ 1 1167/ЕВ 1 1160 АВН 11. пар олигонуклеотидов Формулы ЕВ 1 1161 Бръ 15 . . до сстАтсАсАтАтАААтАсАстсссдстдсссдсттттттсьсдстсс птАсспАтАвтстдтдтттдтстсдссстсдтспстсА 4 ддААстстсАп 1 С . АААТАСТСТТАСТАСТССТСТСТТСТТБТТТТТАТСАСТТСТТСТТТСТТСТ ТТТАТСАСАТСАТСАССАСАВААСААСАААААТАСТСААСААСААА-1 тс - . ввт 1167 СТАААТАСААТАТСАА 6 СТАСАААААССАТАСААТСААСТА СААСААССАТТТАТСТТАТАСТТССАТСТТТТТССТАТСТТАСТТСАТ ТСААСТАТТААС 6 АсттсАтААттсАсст 5.Ев 1 1160 1 1 ХЬО 1 - - ЕВ 1 1161 ЕВ 1 1166 ЕВ 1 1159/ЕБ 1 1168 Формулы ЕВ 1 1161 - 1 Н . 5ХЬО 1 - . гййи СНР 1 сигнал инициирования, Т стоп-кодона и терминатора АВН 11, поили лучеННЫМЦ ВЕКТОПВМИ ЭКСПреСИИ Ьигналвной последовательности.ассЬ или рН 5490 А. ИЛИ Р 5491 А. ИЛИгощусезсегеЧ 1 в 1 ае или человека Р 53 А- ИЛИ Р 5372 А Ил Ры 5373или рЕп 2 ц 7 Ав, или рЕ 025 - Ас, или тдвэфер топ мм трис, рН 7,5, ив нМ рЕ 02 Б АВ, или рЕ 0 д 0, или рЕ 0 д 1 М 5 С 13 1 мн.этилендннитрилотетраукили рЕ 0 д 2 или рЕ 0 д 3, или рЕ 0 дд или сусной кислоты ЭДТУК) . рЕ 0 д 5 или рЕ 050 или рЕ 051-трансФор- 5 агар ЛБ жидкая среда ЛБ 15 г/л бак мируют штаммы Басспагошусев сегеч 1- тоагара - вйае или плазмиду р 5 Ч 2 ЬЕг 5001 или жидкая среда ЛБ 10 г/л бактотрипторБЧ 2 ЬЕг которой трансформируют на, 5 г/л дрожжевого экстракта, Д штаммы культивируемых клеток, культи- 5 г/л НаС 1, 10 М ыаон до рН 7 д вируют трансформированные клетки, 10 раствор лигирования 66 мн трис-НС 1 выделяют и очищают целевой Продукт . рН 7,6, 10 мм М 3 С 12. 5 мн ДТТ, 1 мнтматограФии й раствор нейтрализации 0,5 Н трис 0 При осуществлении предлагаемого Н 61 он 75 П 1,5 М ЫаС 1 способа.используют промотор АВН 1- л 15 буфер 250 мы КС 1, 50 мм ЫаС 1,50 мм(рЕ 5103)-регистрационный номер ВЕН трис-НЕ 1 рН 8,0, то мн М 3 С 1 д р д 013 (фрагмент Ваш Н 1/ХЬО 1 с длиной раствор предварительной гибридизации 1500 п.о. (пар оснований) 0. р 5 к буфер 50, 5 к раствор Денхард ускоренный промотор АПН 1, регистра- та, 50 мн натрий-фосфатного буфера,ционный номер ВМ 4016 (риз 323 Е) 23 рН 6,8, 1 мм Па 2 Р 407, 100 мкм АТР,(фрагмент Ваш Н 1/Хна 10 длиной 0 0,1 додецилсульфата натрияДШНЪ 30 00 пДо.) 0 . 100-(50) мкг/мл денатурированной обтерминатор А 1 Н 11 (рСВ 2) регистра работанной ультразвуком ДНК из спер.ционный номерВМ 4014. (фрагмент мы лососяХЬа.1/Нйпд 111 с длиной 336 по) 25 р 0 ЕА 3.регистрационный номер ЕБМ 4015 буфер Ваш НЕ 150 ММ НаС 1 д 6 дмМ . д 0 5.сееч 1 з 1 ае ВВТд 7 а,1 ец 2, Ь 1 з 3. триснс 1 рН 796 ммм 3 с 1 д. гр 1 Ига 3 . 100 мкл/мл альбумина сыворотки круп- среда СЦУРд 0.57 3 В 7 НВ(В 1 С)ъ ного рогатого скота (АсКРС)0 - Й 22 глюкозы, 22 501 смеси амннокист-буфер Коре 50 мн трис-НС, рН 830 й 3 олот (г/л) гистидин 1 лейцин 5 то мм мдс 1 5 п мм мас 1 - триптофан 2.5 лизин 9 аденин т 2.в.со 11 с 500 Е.-вар Едд. сЬ 11. 100 мм.ыас 1 то мм мдс 1. но мм 2- сЬ 11 ецвв. 1 ас ТТ. Е 9 ПрА 21 йТдТСС меркаптоэтанола 100 мкг/мл АСКРС 3372 ч)- -г р Мчдд взс (гол) 3.0 МЫаС 1. 0.3 М.На 3.Е.со 11-1 Мр 101 гацр Е. сЪ 1.А(дас-рго -цитрата,рН 7,0 Ав),Егарв 36 рго аз. 1 ас 1 Е.о ЗЗРЕ (Зон) 3.6 М НаС 1, 0.2 ншаднРо 4. д 15 - -но 20 мы эдтук ыаон (1 ан.) до рн 7,д10 буфера нтР 2(0.5 Мтвис-НЕ 1 рНа. буферХТП 0 мМНа 01 д 50 мНТчс-НС 1, буфер ТЕ 10 мн трисНС 1 рн 8,0, рН 75.10 мМ НвС 1, Т мНдитиотри 9 т 45.1 мМЭДТУК топа (дтт) 1 э , т -1 буфер ТЬа 1 50 мм трис-НС 1 ъ рН 8,0,6 уферт то мн тринр 1 дн 7-5 1 п мм ы 3 с 1 Г 50 мм ыас 1) 10 днГМ 5 о 1.1 гнд 0 Ътоп-агароза жидкая среда ЛБ 0,72- ции, но без ДНК из спермы лосося 1 мм ЭДТУК, 0,12 дан, содержащий фрагмент КлеНовареакци . -Пор и м е р 1,ный раствор 22 мкл-ДНК/Н 20,25 МКВ К 0 НСТРУИрование генобанка кднк.5 Свежую человеческуюплаценту под 7201 Н М 3 ЗО 4, 1 мм ДТТ, 500 мкп/ у Ргают быстрому замораживанию выжид/мл АСКРС по 1 мкл 2 мм 6 АТР. СТРо ТКОМ ааоте,.растирают в порошок при-аттг 25 ед. фрагмента Кленоаа температуре ниже -8006, экстрагируют.(0,5 мкл) РНК, иа которой получают попи(д)РНКСинтезнруют ДНК, клонируют ее в 3 ЕсоК 1 ъ 510, используя Е.со 11 СЬ 00. Титр кдНК фаговт 51 10 составляет 1,2 х 1 П бляшкообрвзующих ед.Бмл, а число независимых клонов 1 н 10Культуру центрифугируют и суспендируют в 10 мМ раствора сульфата маг-13 ния до оптической.ппотности д 0 при Ь 00 нм. Полученные Не гклеткнхранят. при дС. Клетки смешивают с суспензией фалов (по 50000 бляшкообра- зующих единиц генобанка.ДНК на пластину) и инкубируют в течение 20 мин при 37 С. Затем добавляют расплавлен ную и доведенную дод 2 С топ-агарозу(содержащую 10 мм сульфата магния), 2 смешивают выливают на предварительно 5 нагретые ЛБ-агаровые пластинки (диа 10П р и м е р 3. Первичный скрининг 30 для идентификации рекомбинантных 0-фагов. а). Обработка нитроцеллюлозных фильтров.Пластинки по окончании.инкубации охлаждают до дс. Нитроцеллюлозные фильтры кладут на поверхность-Пласти 1 нок Через 1 мин после пропитки фильтры осторожно удаляют, кладут в раствор денатуратора и инкубируют в течение одной минуты при комнатной температуре Нейтралиэацию осуществеляют в растворе нейтрализатора в те.чение 5 мин при комнатной темпера-у туре, затем инкубируют в течение 30 с в буфере 2 хБ 5 РЕ при той же температуре. С пластины изготовляюту копии. Фильтры высушивают, ДНК фиксируют при 80 С.Синтез олигонукпеотидов проводят на синтезаторе 381 А, 0 лигонуклеотиды очищают электрофорезом в полианриламидном геле 120 в 8 М мочеви- 55 не) с последующим обессоливанием на ,Сефадексе Б-50 Синтезированные та- ким образом ДНК-зонды комплементарныи 200 20716) Они имеют следующие последовательности основании1 с С с а) 5 тс 1 ТА тт тс тс тст 1 АС ттт 3 т т -т .6) 5 тс тот 1 АС тт тс ССА тт 1 АТ 3 с т сС целью удаления с нитроцеллюлозы остатков агарозы и бактерий фильтры инкубируют в растворе предварительной промывки при 65 С в течение НЕСКОЛЬКИХ ЧЭСОВ при ПБРЗМЕШИЗНИИ Фильтры инкубируют в течение 1 12 ч при-температуре 37 Б в растворе предварительной гибридизации,который подвергают предварительной вакуумной.дегазации.Используемые для гибридизации радиоактивно меченные ДНК-зонды (около 1 х 107 срм/мкг) добавляют к нагретому до 37 С и дегазированному раствору гибридизацииьдля поддержания на вы соком уровне концентрации ДНК в раст воре гибридизации используют минимальное количество жидкости Гибри дизацию осуществляют в течение 12 18 ч при 37 С Нитроцеллюлоаные фильтры тритрис-Н 51, рН 8,22 мМ ЭДТУК и 005 ДСН следующим образом три раза при комнатной температуре, два раза в течение 30 мин при комнатной тем пературе и три раза в течение 30 минпри д 9 С, после чего сушат на воздуиз агаровой пластинки выделяют теучастни которые дают положительный-сигнал гибридизации на обоих нитро ЦВЛЛЮЛОЗНЫХ ФИЛЬТРЗХ. ДЛЯ ЭТОГО же лаемое местоупаляют из-агара и переводят в 0,3 - 0,6 млЙ-буфера.Добавляют по одной капле хлороформа,фагам дают диффундировать из агара втечение ночи при дС и каждую отдельную Фаговую суспензию в виде несколь-.КИХ разбавлений НЭНОСЯТ на пластинки.Пластинки, имеющие 300 - 1000 бляшек,снова используют для изготовления копии нитроцеллюлоаного Фильтра, который подаергают.гибридизации с испольэованием обоих ДНК-зондов. Этот процесс повторяют до тех пор, пока все бляшки одной пластинки не дадут положительный сигнал гибридизации. П они м е р 5 Анализ полученных. а) . Титрование Н-фагов. Суспенэии-Фагов разбавляот-буФером в соотношении 110, смешивают и наносят на ппастинкичПослеинкубации при 37 С определяют титр в бляшкообразующих единицах. Для очищенных фаговых суспензий титр составляют 2,2 8611 Од ед мл. б)Попучение 0-фаговой ДНК.После выделения и титрования гомогенныхфаговых кпонов их наносятчашки Петри с культуральной средой следующего состава 1,5 агароэы, 10 г/л триптофана, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л-Ыас 1 10-мм МдБО 4 и 0,2 глюкозы) вместе с 200 мкл Мр 25оклеток Есо 11 С 600 (оптическая-плот ность Ц при 600 нм) иннубируютв течение 5 ч при 3770 и затем охлаждают до дС Элюцию фагов осуществляют переслаиванием пластинок 8 мл тоуфера и несколькими каплями хлороформа при слабом качении при.дСврованием надосадочную жидкость удаляют и фагиоцентрифугируют при 5000 об/мин, в течение 30 минпри комнатной температуре. После добавления 500 мкл Ъ-буфера и инкубации с рибо 40о-нуклеааой А.(10 мкг/мл и дезоксирибо нуклеазой(1 мкг/мл) в течение 30 мин при 37 С и концентрацию соли повы 45 12 мкл 1 М трис-НС 1 рН 80 и 6,5 мкл 202.дСН и инкубируют при 70 С в течение 15 мин. После экстракции Фенолом и двукратной экстракции смесью(2 д 1) ДНК осаждают добавлением 0,1 50 объема ЗИ ацетата натрия с рН 5,2 и 2 объемов спирта, центрифугиоуют промывают 70-ным спиртом, сушат и а). Рестрикционный анализ. 1 55 По 2 мкл раствора ДНК инкубируют с 5 ед. Есокш в буфере Х в течение 2 ч при 37 С, полученные ФрагментыФрагменты длиной 500 - 1000 п.о. элю ируют из геля и подвергают анализу.100 нг фрагментов вотраивают в соответственно приготовленную форму дзДНК (репликативная форма, 50 нг) вектора путем инкубации в течение 2 -112 ч при 1 дС в 10 мкл.раствора лигирования. Рекомбинантной конструкцией с обозначениями ВБЗ. В 5. 338, В 59. В 512, В 51 З В 8 Х 111 трансФормируют компетентные клетки Е.со 11Выделяют однонитееую ДНК рекомбинантных Фагов и проводят анализ последовательностей по Сангеру при использовании вычислительных программ Выделенный клон 8 (В 58) содержит Ткодирующую последовательность аминокислоты 22 зрелого энзина.Для экспрессии человеческой младдисмутаэы (цМпгд 3 в дрожжах используют промотор ДОН первоначальнойдлиной около 1500 п.о., укороченный промотор АВН 1 длиной около 00 п.о. и АВН 11 терминатор, а). Пополнение гена. оТак как у выделенного клона 8 кДНК на Ы-конце отсутствует участок, соответстаующий 21 аминокислоте.дпя пополнения гена конструируют и сиНте 1 эируют с учетом выбора дрожжевого кодона 2 пары опипонуклеотидов (фрагмент-ХЬо 1/ХЬа 1 согласно формулеОП вставляют через Хпо 1/Хра Е 5 ППЗЗМИДУ Ч 17 (Полученную из рПС 18 после рестрикции Н 1 пс 11 и введения