Способ повышения жизнеспособности культивируемых клеток глиомы С6 в условиях оксидативного стресса

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ГЛИОМЫ С 6 В УСЛОВИЯХ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Лукашевич Надежда Владимировна Лукашевич Владимир Сергеевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(56) Жук О.Н. и др. Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования. - Мн., 2001. . 100-102. Гронская Р.И. и др. Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования. - Мн.,2001. - . 77-79. Володкович О.И. и др. Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования. Мн., 2001. - . 66-69. Лукашевич И.Б. и др. Тезисы докладовсъезда Белорусского общества физиологов. - Мн., 2001. - . 93-94.(57) Способ повышения жизнеспособности культивируемых клеток глиомы С 6 в условиях оксидативного стресса, вызванного перекисью водорода, включающий добавление в среду культивирования биологически активной субстанции, отличающийся тем, что в качестве биологически активной субстанции используют плазминоген, причем его добавляют до конечной концентрации 10-7 М. Изобретение относится к физиологии к разделу культивирования клеточных культур. Известен способ культивирования перевиваемых клеточных культур, заключающийся в том, что суспензию клеток плотностью 104 - 105 на 1-10 мл высевают на пластиковые или стеклянные со специальным покрытием чашки Петри в синтетической питательной среде,содержащей 10-15 телячьей, бычьей или лошадиной сыворотки или их смеси и культивируют при 37 С в атмосфере 52 и 95 воздуха. Через 3 суток количество клеток возрастает в 3-5 раз. Культивирование со сменой среды 1 раз в 3 суток продолжают до получения необходимого количества клеток. Для проведения исследований по изучению влияния различных факторов на культивируемые клетки культуральную среду меняют на такую же, но содержащую 0,5 сыворотки (истощенная культуральная среда) и используют для экспериментов (1) - аналог. Известен способ культивирования, при котором добавление в культуральную среду 22 вызывает дозозависимое повреждение клеток глиомы С 6, вплоть до гибели, с изменениями ряда биохимических показателей. Предварительное добавление в культуральную среду эстрогена в концентрации 410-6 М предотвращало гибель клеток и возвращало значения ряда биохимических показателей к норме (2) - прототип. 11798 1 2009.04.30 Общими признаками заявляемого способа и прототипа являются культивирование клеток глиомы С 6 в синтетической питательной среде, как указывалось выше, нанесение повреждающего воздействия перекисью водорода и помещение клеток в среду, содержащую биологически активную субстанцию. Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего повысить жизнеспособность культивируемых клеток глиомы С 6 более специфически, т.е. при более низких концентрациях активной биологической субстанции в условиях оксидативного стресса, вызванного добавлением перекиси водорода. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ повышения жизнеспособности культивируемых клеток глиомы С 6 в условиях оксидативного стресса, вызванного перекисью водорода, включающий добавление в среду культивирования биологически активной субстанции, при этом в качестве биологически активной субстанции используют плазминоген, причем его добавляют в конечной концентрации 10-7 м. Плазминоген - гликопротеин с ММ 85 кДа - является одним из основных компонентов системы экстраклеточного протеолиза. Он секретируется и захватывается некоторыми клетками, инициируя каскад пострецепторных событий, приводящих к усилению клеточного деления. Этим можно объяснить его пролиферативное действие в концентрации 10-10 М,то есть количестве, необходимом для связывания с рецептором. При концентрации 10-7 М его действие особенно выражено. Это связано с тем, что на эффект рецепторного связывания накладывается способность плазминогена изменять свойства плазматической мембраны. Пример суспензию клеток плотностью 104-105 на 1-10 мл высевают на пластиковые или стеклянные со специальным покрытием чашки Петри в модифицированной среде Игла и культивируют при 37 С атмосфере 52 и 95 воздуха. Через 3 суток количество клеток возрастает в 3-5 раз. Культивирование со сменой среды 1 раз в 3 суток продолжают до получения необходимого количества клеток. Для проведения исследований культуральную среду меняют на истощенную и содержащую 0,1 - 110-3 М перекиси водорода. Во второй серии перед добавлением перекиси в культуральную среду вносят 10-7 М плазминогена. Следует отметить, что как концентрация эстрогена - женского полового гормона, неспецифического модулятора клеточной активности - по способу-прототипу составляла 410-6 М, т.е. как минимум в 40 раз выше. Пролиферативную активность клеток оценивают по уровню биосинтеза ДНК, РНК и белка (3), жизнеспособность клеток - микроскопически (4). Перекись водорода в концентрациях 0,1 - 110-3 М вызывает дозозависимую гибель или повреждение клеток, выражающуюся в изменении веретенообразной формы на полигональную или округлую с появлением апоптотических телец. Наблюдалось также дозозависимое падение уровней ДНК, РНК и белка. При добавлении в среду плазминогена наблюдают значительно менее выраженные морфологические изменения. При сохранении дозозависимого угнетения перекисью биосинтеза макромолекул плазминоген, уже при концентрации 22 0,310-3 М, вызывает возврат уровней ДНК и РНК к контрольным величинам. Таким образом, достигаемый технический результат заявляемого способа заключается в протекторном действии плазминогена на морфофункциональное состояние клеток глиомы С 6 в условиях оксидативного стресса, вызванного перекисью водорода. Источники информации 1..,.... . , 1991. - . 207-213. 2.,.,,.6.., 20039971(2)178-88. 3..,, . . ., 1972. - . 136. - .128. 4. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М. Мир, 1983. - С. 93-94. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 2