Промотор синтазы ацетоксикислот для экспрессии генов в растении

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПРОМОТОР СИНТАЗЫ АЦЕТОКСИКИСЛОТ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В РАСТЕНИИ(71) Заявитель АМЕРИКАН ЦИАНАМИД КОМПАНИ(73) Патентообладатель АМЕРИКАН ЦИАНАМИД КОМПАНИ(57) 1. Промотор синтазы ацетоксикислот для экспрессии генов в растении, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в виде 1,2 или 3. 2. Промотор по п. 1, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность гена 1. 3. Промотор по п. 1, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность гена 2. 4. Промотор по п. 1, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность получена из последовательностей промоторов однодольного растения. 5. Промотор по п. 4, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность получена из последовательностей промоторов кукурузы. 6. Вектор трансформации растений, включающий промотор синтазы ацетоксикислот по любому из пп. 15. 7. Способ высокоуровневой экспрессии гетерологичного гена в растении или в его различных тканях,включающий трансформацию растения вектором, содержащим промотор синтазы ацетоксикислот по любому из пп. 1-5, и экспрессию гетерологичного гена в упомянутом растении под контролем указанного промотора. 4799 1 8. Нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность промотора синтазы ацетоксикислот по любому из пп. 1-5, присоединенную к гетерологичному гену. 9. Нуклеиновая кислота по п. 8, отличающаяся тем, что гетерологичный ген является мутантным геном,способным придавать селектируемому трансгенному материалу устойчивость к гербицидам. 10. Нуклеиновая кислота по п. 9, отличающаяся тем, что включенный в нее гетерологичный ген является геном синтазы ацетоксикислот. 11. Способ селекции трансгенного материала на устойчивость к гербицидам, включающий следующие этапы а) рекомбинантная трансформация растительного материала нуклеиновой кислотой, включающей нуклеотидную последовательность промотора синтазы ацетоксикислот по п. 1, присоединенную к гетерологичному гену, придающему устойчивость к гербицидам,б) помещение трансформированного растительного материала на питательную среду, включающую соединение, являющееся гербицидом, и в) идентификация растительного материала, способного расти в присутствии указанного соединения. 12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в качестве гетерологичного гена выбирают ген синтазы ацетоксикислот. 13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанное соединение выбирают из имидозалинонов. Настоящее изобретение относится к изолированным некодирующим нуклеотидным последовательностям, полезным в качестве промоторов для экспрессии гетерологичных генов у растений. Настоящее изобретение также относится к векторам, включающим эти изолированные нуклеотидные последовательности. Царство растений подразделяется на два типа, моховидныеи сосудистые растения . Типвключает свыше 266 000 видов, сгруппированных в четыре подтипа. Подтипвключает класс покрытосеменные . Этот класс делится на два подкласса, двудольные и однодольные. Поскольку однодольные включают многие важные пищевые и фуражные культуры, генетики растений остро заинтересованы в том, чтобы иметь возможность создавать трансгенные однодольные. Известно около 50 000 видов однодольных. Они включают лилии, пальмы, орхидеи, ирисы, тюльпаны, осоки и злаки. Злаки включают кукурузу, пшеницу, рис и все прочие злаковые зерновые. К сожалению, однодольные чрезвычайно тяжело поддаются генноинженерным манипуляциям, так что большинство работ с растениями проводится с двудольными. Двудольные больше по числу видов из этих двух групп, приблизительно известно 200 000 их видов. Лютик,львиный зев, гвоздика, магнолия, мак, капуста, роза, горох, пуансетия (Молочай красивейший,- декоративный кустарник, произрастающий в тропических лесах Мексики, очень популярен в озеленении на юге США), хлопчатник, кактус, морковь, черника, мята, томат, подсолнечник, вяз, дуб и клен представляют 19 из 250 семейств двудольных. Генетическая информация, заключенная в молекуле ДНК, обычно служит шаблоном для синтеза огромного количества более коротких молекул РНК, многие из них в свою очередь выступают шаблонами для синтеза специфических цепей полипептидов. Особые сегменты нуклеотидов, называемые часто промоторами, распознаются молекулами РНК полимеразы как сигнал к синтезу РНК. По окончании транскрипции функциональной цепи РНК второй класс сигналов приводит к прекращению синтеза РНК и к отсоединению молекул РНК полимеразы от соответствующих им шаблонов ДНК. В настоящее время имеется ряд общих промоторов, которые используются для управления экспрессией гетерологичных генов у однодольных растений.и др. (1990) отмечали, что испытания кратковременной экспрессии в конструкции, где промотор гена актина 1 риса (1) был присоединен к бактериальному гену -глюкуронидазыв трансформированных протопластах риса, показали, что промотор актина управляет высокими уровнями генной экспрессии. Эта экспрессия 6-кратно превосходила таковую с геном-промотором алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы (1) и зависела от присутствия интактного интрона 1. 2 4799 1 и др. (1991) отмечали, что оптимизированные векторы для трансформации однодольных были сконструированы при использовании либо промотора 35 вируса мозаичности цветной капусты// , либо промотора 1. Испытания кратковременной экспрессии были выполнены на трансформированных протопластах как риса, так и кукурузы. Добавление интрона 1 и оптимизированного сайта инициализации трансляциик любой промоторной последовательности значительно увеличивало генную экспрессию. Так же, как неопубликованный результат, отмечалось, что промотор актина обнаруживает способность к управлению экспрессиейв кратковременных испытаниях на протопластах пшеницы, овса, ячменя и сорго.и др. (1991) отмечали, что исследования по гибридизациирастений трансгенного риса, выполненные с 1- связыванием, показали, что промотор 1 имеет составной шаблон экспрессии как в вегетативной, так и репродуктивной ткани.и др. (1992) отмечали, что растения трансгенного риса были отобраны на устойчивость к биалофосу после трансформации кусочного гена, экспрессирумого под контролем либо 35 промотора, либо промотора 1 риса..и др. (1992) отмечали, что протопласты кукурузы, трансформированные присоединением гена -1- кукурузы, в испытаниях кратковременной экспрессии обнаружили приблизительно 10 кратно повышенные уровниактивности по сравнению с клетками кукурузы, трансформированными присоединением гена -35-. Нозерн-блот анализ уровней -1 и -1 транскриптов, проводимый вслед за тепловым шоком сеянцев кукурузы, продемонстрировал, что оба гена достаточно хорошо экспрессируются при 25 С, но индуцируются вслед за тепловым шоком.и др. (1992) отмечали, что стабильно трансформированные растения трансгенного риса были получены после электропоратически опосредованной трансформации кусочного гена, экспрессируемого под контролем промотора -1 кукурузы и селекции на биалофос. Этот результат демонстрирует, что промотор-1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у риса, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильных трансгенных растений риса..и др. (1993) отмечали, что стабильно трансформированные растения пшеницы были получены после бомбардировки каллусов, выращенных из незрелых эмбрионов как с кусочным геном, так и с , каждый при этом экспрессировался под контролем промотора -1 кукурузы, за этим следовала селекция на биалофос. Этот результат демонстрирует, что промотор -1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у пшеницы, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильных трансгенных растений.и.(1994) отмечали, что стабильно трансформированные фертильные растения ячменя были получены после микропроекционной бомбардировки тканей эмбрионов ячменя под контролем промотора -1 кукурузы, за которой следовала селекция на биалофос. Этот результат демонстрирует, что промотор -1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у ячменя, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильных трансгенных растений. Эксперимент, включающий бомбардировку небольшого количества растений либо с полосой, либо с 35-полосой показали, что нет существенного различия в полученном количестве трансформантов.и др. (1991) отмечали, что слияние промотор 1 кукурузы -было введено в протопласты риса с целью получения трансгенных растений риса. Активностьу трансгенных растений определяли для выяснения структуры экспрессии . Было обнаружено, что промотор 1 кукурузы способен промотировать базовую экспрессию во всех частях исследованных растений. Как было предварительно продемонстрировано для экспрессии 1 у кукурузы, управляемая 1 экспрессияиндуцировалась в корнях в анаэробных условиях. и др. (1991) отмечали, что промотор 1 кукурузы был модифицирован добавлением мультиплетных копий анаэробного элемента гена 1 кукурузы и элементовгена октопин синтазы. В тестах по кратковременной экспрессии в протопластах различных видов однодольных, трансформированных -, он был лучшим составляющим, дающими 10-15 кратное увеличение уровней экспрессии по сравнению с промотором 35 у пшеницы, кукурузы, риса, пшеницы-однозернянкии плевела многоцветкового.и.(1992) отмечали, что стабильные трансформанты были получены при изменении эмбриогенного каллуса сахарного тростника геном неомицин фосфотрансферазы под контролемпромотора. и др. (1994) отмечали, что промоториспользовался для управления экспрессией четырех различных выбираемых маркерных генов (неомицин фосфотрансферазы, гидромицин фосфотрансферазы, фофинотриицин -ацетилтрансферазы и мутантной ацетолактат синтазы, дающей сопротивляемость гербицидам), которые были трансформированы как в пшеницу, так и в рис. Каллус пшеницы и трансформированные растения риса были получены после селекции трансформантов, демонстрируя, что этот промотор может быть использован для управления экспрессией выбираемых маркерных генов при получении трансформированных злаков. Обзор промоторных элементов, используемых для контроля экспрессии чужеродного гена у трансгенных злаков был недавно опубликован и здесь мы на него ссылаемся (, 1994). Ряд промоторов в настоящее время используется для трансформации двудольных растений. Эти промоторы происходят из различных источников. Одна группа широко используемых промоторов была выделена из, где их функция состоит в управлении экспрессией генов опин синтазы, переносящих сегмент Т-ДНК, который интегрируется в геном растения во время инфекции. Эти промоторы включают промотор октопин синтазы (.., 1985 .., 1985), промотор маннопин синтазы (.., 1985 , 1990) и промотор нопалин синтазы., 1985). Эти промоторы активны в разнообразных растительных тканях. Для управления экспрессией гетерологичных генов двудольных используется также несколько вирусных промоторов (, 1986). Промотор 35 вируса мозаичности цветной капусты - один из промоторов, которые чаще других используются для трансформации двудольных, потому что он дает высокие уровни генной экспрессии почти во всех тканях (.., 1985 ., 1985 .,1986 ., 1986). Используются также и модификации этого промотора, включая конфигурацию с двумя тандемными 35 промоторами (.., 1987) и -35 промотор (.., 1990), который состоит из промотора маннопин синтазы в тандеме с 35 промотором. Оба эти промотора управляют даже более высокими уровнями генной экспрессии по сравнению с единичной копией 35 промотора. Другие вирусные промоторы, которые использовались, включают промотор 19 вируса мозаичности цветной капусты(.., 1984 ..) и 34 промотор из вируса мозаичности норичника(.., 1990). Изучение экспрессииу ряда растений показывает, чтоэкспрессируется во всех растительных тканях.и. (1990) отмечали, что энзиматические тесты, выполненные на различных тканях лимской фасоли, продемонстрировали, что активностьпроявлялась во всех тестируемых тканях, включая листья, стебли, корни, цветки, стручки и меристемы. Активностьобнаруживалась фактически постоянной в стеблях, но уменьшалась в листьях, корнях и меристемах с увеличением возраста тканей..и др. (1993) отмечали, что табак содержит два гена, кодирующие синтазу ацетоксикислот,и . По-видимому, оба гена экспрессируются во всех типах тканей с приблизительно 4-кратным варьированием уровня экспрессии в различных тканях. Развивающиеся органы, по-видимому, имеют наивысшие уровни экспрессии. Исследования гибридизациипродемонстрировали, что наивысшие уровни экспрессии наблюдались в метаболитически активных или интенсивно делящихся клетках. Уровни экспрессиибыли выше, чем удля всех исследованных тканей.и др. (1992) отмечали, что видысодержат мультигенные семейства, кодирующую синтазу ацетоксикислот. Вбыли идентифицированы четыре из пяти генов . Тесты с РНКазной защитой с использованием геноспецифических зондов проводились для определения путей экспрессии различных членов семейства генов у различных видов . Обнаружено, что два из этих генов,1 и 3 хорошо экспрессируются во всех исследованных тканях. Транскрипты 2 обнаруживались только в репродуктивных органах и экстра-эмбриональной ткани семян. Транскрипты, кодируемые четвертым геном, 4, не обнаруживали, и поэтому предположили, что он представляет собой псевдоген.. и .(1991) отмечали, что сравнение активностив молодых листьях и клетках кукурузы/черная мексиканская сладкая/ , выращиваемых в суспензионной культуре, показало, что активность клетокна грамм сырого веса была приблизительно в 5,8 раз выше по сравнению с образцами листьев. Поскольку клеткиявляются активно делящимися, этот результат согласуется с результатами предыдущих исследований табака и лимской фасоли,которые продемонстрировали, что более молодые активно делящиеся ткани обладают большей активностьюпо сравнению со старыми. Ученые исследуют способы применения генетической модификации для придания растениям желательных свойств. Методики генетической инженерии, используемые для улучшения характеристик, таких как 4 4799 1 вкус, структура, размер, устойчивость к вредителям и сопротивление воздействию гербицидов, кислотность или сахаристость растений, употребляемых в пищу, развиваются как более скорая стратегия, чем традиционные методы скрещивания-селекции. Настоящим патентом защищен промотор синтазы ацетоксикислот для экспрессии генов в растении,имеющий нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы последовательностей, представленных в виде 1,2 или 3, причем его нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность гена 1 или гена 2. Указанная нуклеотидная последовательность может быть получена из последовательностей промоторов однодольного растения, в частности кукурузы. Защищен также вектор трансформации растений, включающий заявленный промотор синтазы ацетоксикислот. Кроме того, заявлена нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность заявленного промотора синтазы ацетоксикислот, присоединенную к гетерологичному гену, который может являться мутантным геном, способным придавать устойчивость селектируемому трансгенному материалу к гербицидам. Разработаны также способ высокоуровнего экспрессирования гетерологичного гена в растении и в различных тканях этого растения и способ селекции трансгенного материала на устойчивость к гербицидам. Упомянутый способ высокоуровнего экспрессирования гетерологичного гена в растении и в различных тканях этого растения включает трансформацию растения заявленным вектором, содержащим заявленный промотор синтазы ацетоксикислот, и экспрессирование гетерологичного гена в упомянутом растении под контролем указанного промотора. Упомянутый способ селекции трансгенного материала на устойчивость к гербицидам, включает следующие этапы а) рекомбинантное трансформирование растительного материала нуклеиновой кислотой, включающей нуклеотидную последовательность заявленного промотора синтазы ацетоксикислот, присоединенную к мутантному гену, придающему устойчивость к гербицидам б) помещение трасформированного растительного материала на питательную среду, включающую соединение, являющееся гербицидом и в) идентификация растительного материала, способного расти в присутствии указанного соединения. В качестве мутантного гена выбирают ген синтазы ацетоксикислот, а указанное соединение выбирают из имидазолинонов. Изобретение представлено на следующих фигурах. Фиг. 1 раскрывает последовательность 1 промоторакукурузы ХА 17. Фиг. 2 раскрывает последовательность 2 промоторакукурузы ХА 17. Фиг. 3 раскрывает последовательность 2 промоторакукурузы ХА 17. Фиг. 4 а-с является столбчатыми диаграммами, представляющими -глюкуронидазную активность в кратковременных тестах на протопластах клеток кукурузыили клетках риса в суспензионной культуре после трансформации 221 (а 2-промоторос терминаторная плазмида) или рАС 400 (СаМ 35 ос терминаторная плазмида). Активностьрассчитывали как пмоль/мин/мг протеина. Представлены результаты трех независимых экспериментов. Фиг. 5 является столбчатой диаграммой, представляющей -глюкуронидазную активность в стабильно трансформированных клеточных линиях кукурузыпосле трансформации 221(2-промотор терминатор) или рАС 400 ( 35 терминатор). Активностьрассчитывалась в пмоль/мин/мг протеина. Фиг. 6 - исследования по гибридизациив листовой мутовке двухнедельных сеянцев кукурузы с использованием радиоактивно помеченных РНК-зондов. Срезы тканей были препарированы и гибридизированы с РНК-зондами, кодирующими либосмысловую полосу (-), либоантисмысловую полосу . Для сравнения в качестве зондов использовались(малая субъединица ) смысловая полоса (-) илиантисмысловая полоса . В каждом случае ожидалось, что только антисмысловая полоса будет вступать в гибридизацию с мРНК, присутствующей в ткани.)зонд ) -зонд с)зонд ) -зонд. Фиг. 7 - исследования по гибридизациив сердцевине зародыша кукурузы спустя 12 суток после опыления. Образцы подготовлены так же, как и на фиг. 6. а) эмбрион и суспензорий,зонд ) эмбрион и суспензорий, -зонд -зонд с) перикарп, алейроновый слой и эндосперм, -зонд ) перикарп, алейроновый слой и эндосперм,зонд. 4799 1 Фиг. 8 - исследования по гибридизациив апикальной меристеме молодых растений кукурузы. Образцы подготовлены так же, как и на фиг. 6. а) и )зонд с) и ) -зонд. Характеристики изолированных нуклеотидных последовательностей, включающих промотор синтазы ацетоксикислот для экспрессии генов у растений, представлены на страницах - 18-19 .. 1,-19-20 .. 2,-20-21 .. 3. Промоторыиз кукурузы используются для экспрессии интродуцированных генов на высоком уровне и в различных тканях растений. Промоторы из генов 1 и 2 клонируются и секвенируются(фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3), и промоторные регионы из этих генов затем интродуцируются в плазмиду 5 к генурепортеру -глюкуронидазы . Оба промоторных фрагмента происходят от линии кукурузы ХА 17. Промоторный фрагмент 1 длиной 413 пар оснований, в то время как промоторный фрагмент 2 содержит 509 пар оснований. Чтобы определить активность промоторов , для анализа уровней кратковременной экспрессии химерные плазмиды были затем перенесены в протопласты кукурузы/черная мексиканская сладкая/ и протопласты риса. Для сравнения протопласты были также трансформированы плазмидой с промотором 35, управляющим геном-репортером . Экспрессия химерных плазмид в клетках кукурузы определялась путем анализа ферментативной активности . Активность промотора 2 была равной или превосходила активность промотора 35 в обоих типах клеток(фиг. 4). Фиг. 5 показывает результаты -глюкуронидазных тестов, выполненных на клеточных линияхкукурузы, стабильно трансформированных либо 221 (2 ос терминаторная плазмида), либо рАС 400 ( 35 терминаторная плазмида). Анализ распределениямРНК путем гибридизациирадиоактивно помеченных РНК-зондов в растительную ткань показывает, что промоторыкукурузы активны в большинстве частей растения (фиг. 6, фиг. 7, фиг. 8). Активность промотораанализировалась у растений арабидопсиса, которые были стабильно трансформированы с использованием. Входной промоторный регион генаарабидопсиса присоединялся к гену-репортеру , вставлен в бинарный вектор 19 и далее использовался для трансформации арабидопсиса. Анализы трансформированных растений показывают, что при этом происходит экспрессия(судя по активности промотора) в большинстве частей растения. Настоящее изобретение относится, таким образом, к промоторамкукурузы и арабидопсиса и к векторам, включающим эти промоторы. Применительно к данной заявке, промотор определяется как нуклекотидная последовательность, находящаяся в начале гена, которая действует как сигнал для связывания с РНК-полимеразой. Гены 1 и 2 кукурузы клонируются и секвенируются, и промоторные регионы из этих генов затем интродуцируются в плазмиду 5 к гену-репортеру . Применительно к данной заявке, генрепортер определяется как нуклеотидная последовательность, которая присоединена в конец интересующего промотора, так что транскрипты, инициализирующиеся с этим промотором, затрагивают ген-репортер. Генрепортер обычно кодирует ряд легко определяемых по своей активности ферментов, например в настоящем изобретении экспрессия химерных плазмид в клетках кукурузы определяется анализом активности фермента-глюкуронидазы . Работающий в данной области должен осознавать, что промоторыобладают высокой активностью во многих растительных тканях различного происхождения, и их можно использовать для экспрессии новых генов у разнообразных растений. Новые гены включают, но не сводятся к ним, гены устойчивости к гербицидам, детоксикации и сопротивляемости растительным патогенам. Заявляемые промоторы могут использоваться для экспрессии гетерологичных генов у однодольных,включая, но, не ограничиваясь такими видами, кукурузу, рис, пшеницу, ячмень, сорго, овес, рожь и просо. Работающий в данной области также должен осознавать, что заявляемые промоторы будут также управлять экспрессией у двудольных, хотя экспрессия промоторов однодольных у двудольных, по-видимому, характеризуется более низкими уровнями по сравнению с ее протеканием у однодольных. Работающий в данной области должен осознавать, что промотор 2 кукурузы можно использовать для управления генной экспрессией у других видов однодольных. Например, промотор 1 риса управляет генной экспрессией в протопластах кукурузы, промоторкукурузы использовался для селекции трансгенных пшеницы, ячменя и риса, а промоторарабидопсиса, промотор двудольного, использовали для управления экспрессией генау трансгенных табака и картофеля. Упомянутый 2 кукурузы лучше всего функционирует в кукурузе, но также управляет экспрессией генов у другого однодольного. На основе исследований, выполненных на кукурузе и других видах, следует заключить, что этот промотор будет управлять базовой экспрессией гена у растения везде. Наиболее высокие уровни экспрессии наблюдаются либо в активно делящихся, либо в метаболитически активных тканях. 6 4799 1 Для трансформации однодольных культур использовались разнообразные методики, хорошо известные работающим в данной области, которые однако не ограничиваются микропроективной бомбардировкой,ПЭГ-опосредованной трансформацией, электропорацией и силиконовыми волокнами. Все эти методики включают использование векторов ДНК для доставки нуклеотидных последовательностей, подлежащих изменению. Векторы, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, векторы, переносящие маркерные гены, используемые для селекции трансгенного материала,включая гены, придающие устойчивость к гигромицину, канамицину, биалофосу и гербицидам, производным имидазолинона и сульфонил-мочевины. Следующий пример служит только для иллюстрации данного изобретения и не может быть истолкован как любым образом ограничивающим это изобретение. Пример. Эффективность промоторов 1 и 2 оценивается путем измерения активностив протопластах кукурузы и риса или клеточных линиях кукурузы с конструкциями, в которых эти последовательности промотора присоединены к гену . Приготовление векторов и протокол трансформации описаны ниже. Конструкции, содержащие химерные гены 35-, 1- и 2 Плазмида рАС 400 является рС 19-базируемой плазмидой, содержащей присоединение 418 пар оснований фрагмента - промотора 35, клонированного у головы 1,7- фрагмента -, содержащего гени 700 пар оснований фрагмента -, содержащего терминатор октопин синтазы. Гены 1 и 2 получены путем скрининга библиотеки генома, приготовленной из кукурузы линии ХА 17. Фрагмент -, содержащий 413 пар оснований последовательности у головы кодона АТ инициализации гена 1 субклонирован в рАС 400 на место 35 промотора, и так была образована 223. Фрагмент -, содержащий 509 пар оснований у головы АТ гена 2, был субклонирован спереди того же самого - терминатора связывания в- , и так была образована 221. Последовательность промотора 2 кукурузы ХА 17 представлена на фиг. 3. Трансформация и оценка протопластов риса и кукурузы Протопласты были выделены из клеток в суспензионной культуре рисаили кукурузы (, ) в суспензионной культуре и трансформированы плазмидами рАС 221 В или рАС 400 в соответствии с протоколами ПЭГ-опосредованной трансформации по . (1989) и .(1990). В кратковременных оценках трансформированные протопласты риса распределялись по поверхности милипоровских фильтров, помещенных поверх среды, содержащей питающие (донорные) клетки, и трансформированные протопластыкультивировались в 3 мл жидкой среды. Спустя двое суток после трансформации культура протопластов были собраны и экстрагированы буфером для извлечения . Активностьизмерялась флюориметрически в соответствии с протоколом (1987). Для обнаружения стабильных трансформантов в культуре кукурузы , протопласты были котрансформированы 19 (содержащей выбираемый маркерный ген, кодирующий неомицин фосфотрансферазу) и 221 или рАС 400. После трансформации протопласты культивировались на милипоровских фильтрах, помещенных поверх среды, содержащей питающие (донорные) клетки. Спустя неделю протопласты переносили на среду, содержащую питающие (донорные) клетки и 100 мг/л канамицина. Культуры протопластов переносили на свежую среду Мурасиге-Скуга с 100 мг/л канамицина до тех пор, пока резистентные каллусы не стали видимыми. Индивидуальный каллус, резистентный к канамицину, собрали и выращивали в течение двух-трех недель в присутствии канамицина. Каллус, резистентный к канамицину, окрашивали - или тестировалипо протоколу (1987) с целью скрининга позитивного каллуса. Каллус, идентифицированный как экспрессирующий , измельчали в экстракционном буфере и тестировали, активностьизмеряли флюориметрически. Данные этих экспериментов представлены на фиг. 4 и фиг. 5. Мутантный генкукурузы, ответственный за резистентность к гербицидам группы имидазолинона,и управляемый промотором 2 кукурузы, использовался в качестве выбираемого маркера для получения трансгенного каллуса после трансформации как , так и А 188 В 73 клеток и клеток риса. Этот результат подтверждает идею, что промотор 2 эффективно управляет высокими уровнями экспрессии, что дает ему возможность управлять экспрессией маркерного гена. ГибридизацияПрепараты на предметных стеклах готовились в основном по . (1988). Ткань фиксировали в 4 формалине, обезвоживали в этиловом спирте, очищали в ксилоле и заключали в парафиновую пленку. Из ткани готовили срезы 8-10 м и помещали на предметные стекла, покрытые полилизином. Парафин удаляли ксилолом, и ткань повторно гидратировали (обратная проводка) промыванием этанолом и 7 4799 1 споласкиванием в воде. РНК-зонды готовили из обеих лент (и -) 172-х нуклеотидного фрагмента региона,кодирующего 2, и 392-х нуклеотидного фрагмента региона, кодирующего , используя набор. Препараты на предметных стеклах подвергали гибридизации согласно протоколу. (1988) при 50 С на ночь в разбавлении 14100 л 10 кратных солей (3 М , 10 мМрН 6.8,50 мМ ) 400 л формамида 200 л 50 сульфата декстрана 40 л 10 мг/мл тРНК 10 л 150 л 10 мг/млА/полиаденилат/ с зондом, денатурированном в 50 формалине и 10 мМпри 80 С в течение 30 секунд. Препараты на предметных стеклах промывали дважды по 15 мин в промывном буфере(однократные соли, 50 формамид, 10 мМрН 8, 1 мМ , 10 мМ ) при 50 С, обрабатывали РНКазой А (20 г/мл в ) в течение 30 мин при 37 С, промывали пятикратно вбуфере при 37 С за 1 ч, дважды промывали по 30 мин в промывном буфере при 50 С, обезвоживали в этаноле и высушивали на воздухе. Препараты на предметных стеклах автора-диографировали путем погружения в эмульсию, предварительно нагретую до 37 С в темноте, высушивания в течение 30 мин-1 часа и хранения в темноте при 4 С до проявления. Препараты проявляли в течение 2 мин, ополаскивали в воде, фиксировали в течение по крайней мере 5 мин и снова ополаскивали в воде. Ткань окрашивали с помощью(синий краситель) и обесцвечивали в этаноле и ксилоле. После установки в предметный столикткань просматривали с использованием микроскопа темного поля. Данные экспериментов по гибридизациина фиг. 6-8 показывают, что ген в эмбрионе кукурузы экспрессируется везде. Оказывается возможным оценить экспрессию промоторапутем 1) конструирования гена связывания 2- и определения структуры активностиу трансгенных растений кукурузы или риса. Предыдущие исследования с использованием промотора кукурузы продемонстрировали пригодность оценки экспрессии промотора кукурузы у риса (., 1991). После селекции трансгенных растений с целью определения как специфичности по ткани, так и по типу клеток были выполнены гистохимические анализы растительных тканей на различных стадиях развития. Этот способ обычно используется для оценки активности промотора как у однодольных, так и у двудольных 2) оценки кратковременной экспрессии проделаны на протопластах, полученных от различных видов растений после трансформации конструкций 2-. Этот подход используется для оценки способности различных промоторов функционировать у гетерологичных видов. Протопласты трансформировали с помощью интересующей конструкции и выдерживали для того, чтобы интродуцированный ген экспрессировался и накопился соответствующий протеин. После такой выдержки клетки тестировались на присутствие протеина, кодируемого трансгеном для определения эффективности управляемой промотором трансгенной экспрессии. Источники информации 1.., (1990). Изоляция эффективного актин промотора для использования в трансформации риса.2 163-171. 2.., (1991). Конструкция векторов экспрессии, основанных на региональном актин 1(1) риса для использования в трансформации однодольных растений. . . 231 150-160. 3.., (1991). Анализ активности 5 региона в трансгенезе растений риса.3 1155-1165. 4.., (1992). Регенерация гербицидной резистентности трансгенеза растений риса в связи с промежуточной трансформацией суспензионной культуры клетов.586-591. 5..., (1992). Полиубиквитин гены кукурузы структура, термальная пертурбация экспрессии и транскрипция сплайсинга, и активность промотора, следующая за передачей к протопластам путем электропорации.18 675-689. 6.., (1992). Экспрессия убиквитин генетического промотора кукурузы - бар химерного гена в трансгенезе растений риса.. 100 1503-1507. 7.., (1993). Ускоренное продуцирование со сложной структурой независимых линий фертильной трансгенной пшеницы. ( ).. 102 1077-1084. 8.. , (1994). Генерация большого числа независимо трансформированных растений ячменя.. 104 37-48. 9.., (1991). Анаэробная индукция и тканеспецифичная эксперессияпромотора кукурузы в трансгенные растения риса и их потомство. . . . 228 40-48. 4799 1 10. ., (1991).улучшенный промотор для экспрессии гена в клетках злаковых. .. . 81 581-588. 11..(1992). Трансгенные растения сахарного тростника, полученные путем микропроекционной бомбардировки.2 (3) 409-416. 12. . .., (1994). Использованиепромотора с антибиотической и гербицидной резистентностью генов для селекции каллуса растений трансгенной пшеницы и риса. . . . ., 21 95-112. 13. .. (1985). Экспрессия в растениях мутанта аА гена изсравнивается с толерантностью к глифосфату.317 741-744. 14. С.. (1985). Резистентность к гидромицину В новый маркер для изучения трансформации растений.. . 5 103-108. 15.. ,.(1990). Улучшенные бинарные векторы для трансформации- растений.. . 14 269-276. 16.. (1983). Химерный ген с антибиотической резистентностью в качестве пригодного для селекции маркера для трансформации растительной клетки.304 184-187. 17.-. (1983). Экспрессия химерных генов, трансформированных в клетки растений путем использования -плазмид- разветвленного вектора.304 209-213. 18.Т.. (1983). Экспрессия бактериальных генов в клетках растений. 80 48034807. 19.. (1984) Экспрессия инородных генов в регенерированных растениях и их потомстве..3 1681-1689. 20. .. (1985). Ввод, интеграция, экспрессия и генетическая трансмиссия пригодных для отбора химерных генов протопластов растений. . . . 199 161-168. 21. .(1986). Транскрипциональные регуляторные последовательности,полученные из вирусов растений.4 4-8. 22.Т.. (1985). Идентификация ДНК последовательностей, необходимых для активации 35 промотора вируса мозаики цветной капусты.313 810-812. 23..(1986). Временная и устойчивая экспрессия гена люциферазы светляков в клетках растений и трансгенных растений.234 856-959. 24. . (1896). Инженерия гербицидной толерантности в трансгенных растениях.233 478-481. 25.. (1987). Дупликацияпоследовательностей 35 промотора создает сильный энхансер для растительных генов.236 1299-1302. 26. .. (1990). Новые и полезные свойства химерного растительного промотора в комбинации 35 иэлементов.. . 15 373-381. 27. .. (1984). Прямая передача гена в растения. . . 3 2717-2722. 28.., (1985). Конструкция химерного вектора для трансформации высших растений.40 343-348. 29.., (1990). Характеристики сильного промотора для вируса мозаичности норичника шишковатого. Сравнение с аналогами 35 промотора для вируса мозаичности цветной капусты и промотора маннопин синтазы.. . 14 433-443. 30..(1990). Активность тканевого распределения синтазы ацетооксикислот на различных стадиях развития фасоли лима.. 30 (4) 418-419. 31. . .., (1993). Экспрессия регуляции гена актиолактат синтазы табака.. 102 1009-1018. 32.., (1992). Органы синтазы ацето-оксикислот мультигенного семействаимеют различные паттерны экспрессии.2 321-330. 33...(1991). Взаимодействия синтазы имадозолинон-ацетооксикислот.... 0( , .). 34. (1987). Анализ химерных генов в растениях система слияниягенов...5 387-405. 35. . (1989). Стабильная трансформация протопластов кукурузы сигенами.13 151-161. 36. ., (1990). Ко-трансформация протопластов рисасигенами.9 168-172. 9 4799 1 37. ., (1988). Экспрессия клеточных паттернов фотосинтетического гена в развивающихся листьях кукурузы.. 2 106-115. 38. Е.., (1988). Гибридизация на месте в растительных клетках РНК.. . НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ кодирующая 5 к структуральному гену (промотору) для синтазы ацето-оксикислотиспользуемая для экспрессии в интродуцированных генах растений. АДРЕСАНТ Америкен Цианамид Компани УЛИЦА Уан Цианамид Плаза МЕДИУМ ТИП Флоппи диск ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА -/ СОФТВЕЙР Патентные документы 1.0, Версия 1.25 ТИП нуклеиновая кислота 10 ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 15