Способ очистки человеческого -интерферона

боковой цепью Аффиа-геля 1 ОЙ(фирмы Бис-Рад лаб. именуемой ниже БиоРадЧ через пептидную связь с полисахаридным носителем. Можно также использовать другие носители,например поперечно связанный декстрановый гель, например Сефадекс . (ФИР ма Фармесиэ, и виниловый полимер с гидроксильными группами, который также можно использовать как носитель для для хелатметаллической хроматографии в следующей стадии, предпочтителен гидрофильный граиулированнй полимер, например, Тойопрлс. (фирма Тойо сода комп.). Предпочтительно использовать синий агарозовьи гель, соответствушщи. В), так как он весьма эффективно связывается с интерфероном, не вызывает отделения красителя от носителя,поскольку соединение красителяс ио сителем является весьма стабильнымв условиях рН от 6 до 13, и онлегковый гель имеет следующую СТРУКТУРУ И реализуется под товарнм наименованием -Блу сефароз СЬ 6 В(фга.ФЗРНе сиз) Матрекс гель бпу А (Фирма Амикон корп) н Аффигель 5 бЛУЕ Для контактирования обездвиженно го синего носителя с раствором сырого интерферона можно использовать либо порционный метод, либо колонныйснособ.П р ним е р 3. Раствор сырого интерферона бьш получен путем обработки человеческих фибробластовык клеток в среде МЕМ Игла, содержавшей О,д 2 нетипцеллюлозы с поли 1 полн С, с последующей обработкой циклогексиидом иактиноммциноМ П.К 3 О л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 6,281105 имед было добавлено 21 мгбелка и 100 мкц актиномцина Д на 1 л, 30 мл геля синей агарозы (Аффи гель блу фирмы Био-Рад), после перемешивания в течение 40 ч и вы 30держивания в течение 3 ч надосадочная жидкость была извлечена, и гельагарозы бЬШ ПЕРЕНЕСЕН В КОПОННУ, Спромывкой физиологическим раствором, содержащим фосфатнокислотный буфер,Надосадочная жидкость была извлечена снова, Колонну дважды промвали и элюировали Использовали следую щие промывочые растворы и элюент первый промывочныи раствор(320 мл) раствор 1 ОМ хлористого натрия, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рн 7,2) второй промывочны раствор(280 мл) 25-ный растворэтиленгликоля содержащий 10 ММ фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2) элюент (400 мл) 55-нйрастор этиленгликоля,содержащй 10 мМ фосфорнокислого натрия н 1,0 М хлористого натрия(рН 7,2).интерферонав элнате(30 О М) 81 от исходного раствора интерферона, очищение в 33 раза.В колонну с хелатом цинка 10 ми) элюат (285 мл) и колонны геля синей еагарозы пропустили при скорости лотока 20 мл/г После двойной проывки-колонну элюировалн. Использовали следующие проывочные растворыи элюент(зоо мл) дистиллированную воду и 0,Г М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали при скорости по тока 30 мы/г в течение 1 ч поочередновторой промывочн раствор (50 мл)20 МНрастворлимоннокислого натрия (рН,5,О) ЭЛЮЕНТ 3 - - 0,1 Н буферый раствор уксусная кислота - уксусиокислыиатрий (рн 4,5). А Выиодхелатцинковой хроматографии 872, а общй выход 70, Достигнута очистка в 330 раз. 7 Активность и выход интерферона,количество белка и удельная актив НОСТЬ КЗЖДОЙ СТДДИИ ПОКВЗЗНЫ В табп..Анализ активности интерферона посредством электрофореза лолиакриламид ного геля.Часть конечного элюата подвергли диализу в присутствии додецилсульфа та натрия (НДС) и лиофнлировали После восстановления лиосмлированного гдиализата 2 меркаптоэтанолом восстановлеиный материал подвергли электро 10 форезу с использованием волиакрилт амидного геля в присутствии НДС согласно способу Лэмли(Нейчэр 227,680-685 (1970 для проведения анали за активности интерферона и красите- 15 ля с блестящей синью В 200.В результате активность интерферона и темиосиняя полоса были обнаружены только в положении, соответствовал шем молекулярному весу примерН 9 20 23000. 0Анализ актиноммцина Д был провет дан способом биологической пробывЧасть конечного зплата обессолили 25 путем гельтхруатографин, используя Сефадекс О 25 после добавлении сывороточного альбумина человека .(1-мг/мл). Добавляя дополнительно небольшое количествосывороточного 30 альбумина человека и лактозы обессоленный зпюат профипьтроваличерезфильтр 2 мкм и лиофилировапи. Актиномицин Д был обнаружен в количестве не больше 00003 мкг/105 им.ед. акг тнвностн интерферона.Элюат из колонн геля синей агароэы содержал 07 мкг/М актиномМцина Д Общее количество актиномицина-Д составило 210 мкг. Кроме того, при до сутствие актиноммцина Д в элюате из колонны геля синей агароэы было обч нарушено по поглощению (430 нм) и путембиопробы 1 Часть элюата из колонны геля сит- Б ней агарозы обессолили способом гельхроматографии с использованием Сефадекс 6-25 после добавления человеческого сыворот 0 чиогоальбумина.эпюат лиофипировали. Все же было обнаружено около 0,7 мкг/195 им.ед. интерферонной активности актиноммциПирогенноейспытание На КРОПНКЗХ. ППУЧЕННЬПЙ УКЗЭЗННЪДМ ВЪШТЕ СПОСО БОН ИЗ ПОНЧНОГО ЭПЮаТа ПНОФНЛИРОНЗН нй материал инъектировалн внутривенно трем кролнкам (2-105 нм.ед./кгд массы кролика). Суммроваиие пиренсии для всех треикроликов было 06 с.Интерферон, очищенный по предлагае мому способу, оказался отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах.Лиофилированный материал, попучеинй из елюата колонны геля синей агарозы инъектировали внутривенно трем кроликам (2- 10 5 им. ед/кг массы крОлика) Суммрование пирексии для ВСЕХ ТРЕХ кроликов было 15 С. Интерферон, очищенный согласно способу хроматографии синей агарозы, оказался неопределенно отрицательным к пирогеи ному испытанию на кроликах.П Р И М е р 2. В этом эксперименте использовали раствор сырого интерФеР 0 НаП 0 добный использовавшемуся в примере Е.20 л раствора сырого интерферона пропустили через колонну синей агароэы объемом 20 мл (Матрекс гель ПУ АС) , фирмы Амикон корп). Ко ЛОННУ трижды ПРОМЬШИ И ЭПЮИРОВа-ПиаИспользовали следующие промывочные Растворы И эпюент первый промывочнй раствор1 М хлористый натрий, содер жащй 10 мм фосфорнокислого натрия (рн 7,2).25-ный раствор этиленгликоля,содержащий 10 ММ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рн 7,2).40-ный раствор этиленгликоля,содржаышй 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2). элюент.(200 мл) У А 55-иый раствор этиленгликоля,содержащй 10 ММ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрня. Хелатцинковую колоннуК 5 м) сеет дннилис выходом колонны синей агароэы после начала элюировании, и злюат из колонны синей агарозы непосредСТВЭННО ПРОПУЦКЗПИ через хе-ПЭТЦИНКОНУЮ КОПОНУв Затем ХВПЗТЦНКОВУ КОлонну дважды промдьши и элюировалн, Промывочные растворы н элюент былиСЛЕДУЮЩПШпервый промывочный растворвторой промыночный раствор (20 М) 20 мМ лимоннокислы натрий(рн 5,0) элюент 0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий, . ч содержащий 1 М хлористого иат- П р и м е р д. Была повторена рия, лроцедурапрнмера 3 за тем исключениИнтерферонная активность, выход, ч 15 ем, что хелаткобальтовую колонну исколичество белка иудельная актнв- полъэовали вместо хепатнкслевойко иость каждой стадии показаны В лониы, причем хелвткобальтовую кддр.та 5 л 2 р . . лонну-приготовиликакв примере 1, П р и м е р 3. 20-л раствора сы ровместо хлористого цинка использова рого интерферона с интерферонной акд 20 ли раствор хлористого кобальта. 6-синеагарозного носителя иатрекс белка. Удельная активность составля гелв Влу.Аа 9 фирм ЧАмкои корп.). да 1310 Б Ими еда/МГ белка. Конеч Носитель, на которы был адсорбиро 25 той элюат был отрицательны к испытаван интерферон, загрузили на колон- ниш Пимулуса. В немне было обнару ну. Затем колонну дважда промыли и жено актинонцина Д.промывочные растворы нэлюент штамм Е. коли, в котором был интегпсрвы лромывочный раствор 30 рирован структурый ген 5 тиитерферо(400 мл) на, и культивированый штам-подверг раствор хлористого натрия 1 М, ли процедурам сбора бактерий, измель.содержащнй 10 мм фосфорнокисло чвния бактерий, деления нуклеиновой го натрия (рН 7,2) Кислоты И-осаждения сульфатом амо второй промывочный раствор ний. БелховУЙ ФРацйю содержащую(400 мл) 35 5-интерферон, полученный из штама 252-ни раствор этиленгликоля, Е.кол растворили в 25 ном раствосодержащий 10 мМ фосфорнокисло- ре этиленгликоля, содержащем 1 М хло го натрия и 1 М хлористого нат- ристого натрия и 10 мм фосфорнокисло . рни (рн 7,2), 40 го натрия-(рН 7,2) с целью получения элюеит(40 О мл). раствора сырого интерферона. Раствор 100 мл раствора интерферона, отоб сырого интерферона имел интерферонранного иахолонны синей агарозы, про-. НУЮ активность 5 ч 10 Б нМоед И 20 МГ пустили через 5 мл хепатникелевуы ко- белка на 1 ип . .,лоннн. Использованнаи колонна халата д 5 40 мл раствора сырого интерферо.никелл была приготовлена так же,.как на пропустили через колонну 2 нлэвместо раствора хлористого цинка ис- фирмы Амкои хорп.), уравновешен полъзовали раствор хлористого никеля- ную буферным раствором фосфорнокисло Хелатникелевую колонну промыли и го натрия, содержащим 1 М хлористогоэлюировали. Использовали следующие натрия, Колонну дважды промли спромывочный раствор ц . чп растворе сырого интерферона, Н элюиродистиллированнаа вода и 0,1 М вали с фракциоиированием в каждую фосфорнокислого натрия (рН 6,7) фракцию 2 и. Испопьзоваписпедуюие использовали ПООЧВРЕДНО ПР 0 ывочиые растворы и эпюент .элюент - нервы проывочныйраствор ГО мл) 0,2 М буферий раствор ухсусн 252-нй раствор этиленгликоля,ная кислота - УКСУСНОКЙСЛЫЙ содержащй-1 М хлористого нат натрий, содержащий М хлорис того натрия (рН 4,5). Интерферонная активность, выход,количество белка и удельная актив НОСТЪ каждой стадии показаны в табл 3 Конечный элюат содержал весьмамалое количество пнрогенных веществ И был отрицательным.относителвно испы до талии Лимулуса. В нем не было обнаружено актииомцина Д.рия н 10 мМ фосфорнокислого натриявторой промывочный раствор (10 мл) 40-ный раствор этиленгликоля,содержащий М хлористого натрия-р 10 нм фосфорнокислого натрияэлюент 602-н раствор этиленгликоля,содержащий 1 М хлористого натт рия и 10 мм фосфорнокислого натрияЭпфат (12 мл) на колонны синей агарозы имел интерферонную активность 1,6-107 ин.ед выход 8021 и 4,6 Мг бслка Средняя удельная активность в каждой фракции была 2,5-107 им.ед/мг 5-10 им.едд/мг белка).Элюат подвергли анализу так же,как в примере 1. В результате чистота интерферонной активности при молеку ртлярном весе лримерно 19000 составляла О 50 средняя 25). А6 мл эиюата из колонны синей агароецвы пропустили через 1 млхелатцинко вой колонн, уравновешенной 6 Пвым раствором этиленгликоля, содержали 1 М хлористого натрил и 1 мМ фосфорнокислого натрия. Колонну трижды про дующие проывочные растворы и эпюент первый промывочный.раствор (6 мл) 60 ный раствор этиленгликоля ,содержащй 1 М хлористого натрия и 10 мм фосфорнокислого натрия А второй промывочнй раствор (6 мл) дистиллированная вода третий промывочнй раствор (6 м) 220 мм буферный раствор фосфорнокислого натрия, содержащй 2 М хлористого натрия (рН 6,0). ЭЛюеНТ 0,1 М буферный.растворуксусно кислого натрия, содержащй 1 М хлористого натрия (рН 4,О) Конечнй элюат (д м) имел интерт феронную активность д,О-107 им.ед.активность была 10 в им. ед./мг белка. 7 Конечнй элюат подвергли анализу как И в примере 1 и обнаружили одну полосу вположении молекулярного веса примерно 19000. Чистота была больше 97. ц .П р н м е р 6. Была ловторена про цедура примера З, за тем исключеннемдтчто вместо иелатникелевой колонн использовали хелатцинковую колонну нв качестве элюента исполъэовали 02 Мраствор Еьгистиднн, Н уравновешенный хлористый натрием (рН 7,0).Элюат (20 т имел 50-10 им.ед интерферона (выход 67) и 50 г общее го белка. Удельная активность была 1,0-10 им.ед./мг белка,К 20 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 42-10 имаед. и концентрацией белка 70 мг/л добавили 30 мп геля синей агароэыСматгех Се 1 В 1 ие АдАш 1 сол остр) После перемешивания смеси в течение 3 сут и выдержки в течене Зри удали ли надосадочный слой и гель синейагарозы пропустили через колонну, промывая 200 м 1,0 М раствора хло ристого натриясодержащего 10 ММ фосфата натрия с рН 732 буфер А). 3 атем колонну дважд прошли.Перед элюированнем интерферона для улучшения очистки к выоду вышеукае ванной колонки подсоединили колонку с 15 мл свежего геля агарозы, уравновешенного буфером А,содержащим 252 ны раствор этиленгликоля. После третьей проывки интерферон элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюентпервый промывочный раствор (200 МЛ) буфер Авторой промывочвй раствор (300 мл)буфер А,содержаший 25 раст-вор этиленгликоля, третийпромывочны раствор 3 М раствор хлористого натрия,содержащий 30 мн фосфорнокислое го натрия (рн 7,2) и Зойтый-раствор этиленгликоля, элюент (600 мл) буфер А, содержащий 552-НЫЙ раствор этиленгликоля, Раствор злюата фракцноннровали Результаты представлены в табл.д.фракцию второго.элюированя подвергли дальнейшей очистке с помощю иелатцинковой хроматографии.