Рекомбинантная плазмидная ДНК для получения антигена вируса гепатита С

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА С(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Владыко Александр Станиславович Фомина Елена Георгиевна Счесленок Елена Павловна Школина Татьяна Владимировна Семижон Павел Анатольевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Рекомбинантная плазмидная ДНК для получения антигена вируса гепатита С, содержащая не менее чем две копии аминокислотной последовательности ,кодирующей антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка вируса гепатита С, клонированные в полилинкер экспрессирующего вектора 4 пои Арасайтам рестрикции. Настоящее изобретение относится к технологии получения рекомбинантной ДНК и может быть использовано для экспрессии полипептида, содержащего повторы антигенных детерминант с целью усовершенствования имеющихся диагностических тест-систем. Более конкретно, настоящее изобретение относится к рекомбинантной плазмиде 40, которая в качестве вставки содержит тандемно повторяющуюся (не менее 2-х повторов) нуклеотидную последовательность, кодирующую только антигензначимые участки нуклеокапсидного белкавируса гепатита С (ВГС). Сконструированным вектором трансформируют бактериальные клетки, в частности клетки, штамм 21, для обеспечения экспрессии рекомбинантного полипептида. Выбор нуклеокапсидного белка для диагностики обусловлен тем, что использование структурных белков вириона целесообразно для ранней диагностики инфекции, так как показано, что антитела к белкуявляются самыми ранними маркерами инфекции ВГС. В настоящее время известно достаточно много рекомбинантных плазмидных ДНК, которые кодируют как полноразмерный нуклеокапсидный белок вируса гепатита С, так и отдельные антигенные детерминанты 6178-7, 471 кодируют полноразмерный нуклеокапсидный белок,105-302 кодирует первые 150 аминокислотных остатков(а.о), и ряд плазмид, которые содержат отдельные последовательности из составав виде гибрида с -галактозидазой(содержит 19-31 а.о. )(содер 11618 1 2009.02.28 жит 1-25 а.о. )(содержит 1-80 а.о. )(содержит 1-160 а.о. )(содержит 55-72 а.о. )(содержит 33-56 а.о.)(содержит 58-84 а.о. ) полученные в институте им. Д.И. Ивановского РАМН Петракова Н.В., Калинина Т.И., Худяков Ю.Е., Газина Е.В., Смирнов В.Д. Получение и очистка рекомбинантного полипептида, содержащего антигенные детерминанты сердцевинного белка вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. - 1997. -5. С. 208-212 Масалова О.В., Атанадзе С.Н., Калинина Т.И., Петракова Н.В., Смирнов В.Д., ., Худяков Ю.Е., Кущ А.А. Иммунохимические свойства и специфичность моноклональных антител в отношении - и С-концевых участков рекомбинантного белка нуклеокапсида вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. - 1996. -2. - С. 150-153. Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленной рекомбинантной плазмидной ДНК является плазмида 105-302, которая кодирует первые 150 аминокислотных остатков сердцевинного белка (прототип) Петракова Н.В., Калинина Т.И.,Худяков Ю.Е., Газина Е.В., Смирнов В.Д. Получение и очистка рекомбинантного полипептида, содержащего антигенные детерминанты сердцевинного белка вируса гепатита С// Вопросы вирусологии. - 1997. -5. - С. 208-212. Недостатками известной плазмиды является то, что данная плазмида наряду с антигензначимыми участками белкасодержит последовательности, которые не имеют антигенной значимости и могут неспецифически связываться с антителами, содержит неповторяющийся (один) антигензначимый участок. В основу заявленного изобретения положена задача получения рекомбинатной плазмиды в которой а) в качестве вставки содержатся только антигензначимые участки нуклеокапсидного белка вируса гепатита С б) антигенные детерминанты повторяются в составе вектора не менее двух раз (способ мультипликации). Получаемые на основе рекомбинатной плазмиды полипептиды могут быть использованы в качестве высокочувствительного и специфичного антигена в иммуноферментной реакции для диагностики вируса гепатита С. Технический результат выражается в повышении чувствительности иммуноферментной реакции за счет увеличения количества образующихся комплексов антиген-антитело и специфичности за счет элиминации последовательностей, не имеющих антигенной значимости. Технический результат достигается тем, что рекомбинантная плазмидная ДНК для получения антигена вируса гепатита С, содержащая не менее чем 2 копии аминокислотной последовательности , кодирующей антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка вируса гепатита С, клонированные в полилинкер экспрессирующего вектора 4 поисайтам рестрикции. Изобретение проиллюстрировано графическими материалами, на которых представлены фиг. 1 - профиль гидрофобности аминокислотных остатков нуклеокапсидного белка вируса гепатита С фиг. 2 - данные сканирования базы данных вирусов животных и растений на наличие антигенных детерминант, идентичных нуклеокапсидному белку вируса гепатита С фиг. 3 - нуклеотидная последовательность праймеров, используемых для клонирования фиг. 4 - циркулярная карта экспрессирующего вектора 40 и его нуклеотидная последовательность с позиции 1 - 280 фиг. 5 - рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид (дорожки 1 - маркер молекулярных масс 502 - рекомбинантная плазмида 401, гидролизованная ферментами рестрикции,3 - рекомбинантная плазмида 402, после гидролизаирестриктазами 4 - рекомбинантная плазмида 404, гидролизованнаяиферментами рестрикции) и следующие примеры приведенные ниже. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию проводили по известным методикам Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М. Мир, 1984. - 480 Клонирование ДНК. Методы / Под редакцией Д. Гловера, перевод с англ. - М. Мир, 1988 // . 1988. - . 239, 4839. - . 487-491. 2 11618 1 2009.02.28 Поставленная в заявленном изобретении задача, с достижением упомянутого выше технического результата, решалась следующим образом Определение антигензначимых участков 1. С помощью компьютернойпрограммы были проанализированы профили гидрофобности аминокислот белка(фиг. 1). Белоксодержит три гидрофильных участка (выделенные цветом аминокислотные остатки), которые экспонированы на поверхности молекулы и вероятно являются участками связывания антител. Эти участки сосредоточены в первых 120 аминокислотных остатках нуклеокапсидного белка. 2. Просканирована существующая в настоящее время база данных вирусов животных и растенийдля определения возможных перекрестов, выделенных по профилю гидрофобности и гидрофильности антиген значимых участков (фиг. 2). Как показали данные поиска, только первый сайт является видоспецифичным, состоит из 16-ти аминокислотных остатков и кодирует следующие аминокислоты . Второй антиген значимый участок может давать перекресты в иммуноферментных реакциях с 41, - , ,и др, третий,,и др. Для системы тандемно повторяющихся антигенных детерминант нами был выбран первый из трех сайтов, т.к. он не дает перекрестов с другими вирусами. Получение рекомбинантной плазмиды, кодирующей повторы антигенных детерминант нуклеокапсидного белка вируса гепатита С. 1. Синтезированы шесть пар праймеров для реакции полимеризации, каждый из которых содержит 68 нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный сайт (16 а.о.), и сайты для ферментов рестрикции (фиг. 3). В качестве обратного праймера выступала нуклеотидная последовательность, состоящая из 15 нуклеотидов. Каждая последующая пара праймеров отличается от предыдущей только сайтами рестрикции, необходимыми для клонирования в полилинкер ( ,- первая пара праймеров,- вторая пара праймеров,- третья пара праймеров,- четвертая пара праймеров). Праймеры были полимеризованы в реакции с фрагментом Кленова, обработаны ферментами рестрикции и клонированы последовательно в полилинкер экспрессирующего вектора. В качестве экспрессирующего вектора использовалась плазмида 40(фиг. 4). Основными особенностями этого вектора являются большое количество сайтов,удобных для клонирования стоп-кадон расположен близко к(- ),что предотвращает добавление аминокислот к С-концу продукта маленький размер (2402 п. н.), что удобно для различных манипуляций с плазмидной ДНК сильный ориджин репликации. Плазмида устойчива в штаммах . 5, -и 21 (3). 2040 -7-//. - 1994. -5. - . 133-137 В клеткахэтот вектор позволяет получать до 10 рекомбинантного белка от тотального клеточного синтеза при индукции изопропилтиопираногалактозидом . В дополнение, эта экспрессирующая система содержит последовательность из 10 остатков гистидина, что позволяет очистить рекомбинантный белок с помощью металлхеллатной хроматографии, а также полилинкер, содержащий сайты, удобные для клонирования. Таким образом, получена рекомбинантная плазмида, которая в качестве вставки, содержит последовательность из четырех повторяющихся антигенных детерминант, на основе экспрессирующего вектора 40. Пример 1. Получение плазмиды 401 (содержащей вставку одной антигенной детерминанты). Реакция полимеризации. В пробирку помещали первую пару праймеров 1 НЕи 1(200 нг каждого),нуклеотидная последовательность праймеров представлена на фиг. 3. 3 11618 1 2009.02.28 Отжиг праймеров проводили в течение 15 мин при 50 С, затем в реакцию добавлялив конечной концентрации 200 мкМ, буфер для фермента Кленова 1, фермент Кленова 0,5 , данную смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Полученный фрагмент анализировали в 2 агарозном геле. Рестрикция вектора и полимеризованных фрагментов. Рестрикцию вектора и полимеризованных фрагментов ДНК проводили при 37 С в течение 2 часов последовательно рестриктазамии, входящими в состав полилинкера экспрессирующего вектора, в конечном объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержала 0,2 мкг двухцепочечной полимеризованной ДНК, 1 буфер для рестриктаз, 1 каждого фермента рестрикции. Ферменты рестрикции инактивировали в течение 15 мин при 65 С. Лигирование. Лигирование рестрикционных фрагментов в вектор проводили в течение 18 часов при 4 С, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,2 мкг ДНК, 1 ДНК лигазы, 1 лигазный буфер. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки . штамм 5 , ,.,., 17, 3469-3478, 1989 и высевали на чашки Петри с ампициллином (50 мкг/мл). Подготовка компетентной культуры. Отдельную колонию штамма 5 вносили бактериологической петлей в 5 млбульона, помещали на шейкер в термостат и инкубировали в течение 2-3 часов до достижения культурой логарифмической фазы роста. Полученную культуру охлаждали до 4 С и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспензировали в 0,5 мл охлажденного 0,1 М раствора 2, оставляли на 2 часа при 4 С. Бактерии осаждали 10 мин при 3000 об/мин, осадок ресуспензировали в 0,1 мл охлажденного раствора 2. Трансформация компетентной культуры плазмидной ДНК. В 100 мкл компетентной бактериальной культуры вносили 20 мкл лигазной смеси, выдерживали 30 мин при 4 С, делали тепловой шок 30 сек при 42 С, затем помещали на лед на 3 мин, осаждали и высевали на чашки Петри с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл,ставили в термостат на 37 С на ночь. Клоны, полученные после трансформации, рассевали штрихом и выделяли из них плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Отбор корректной плазмиды производили по размеру и в дальнейшем анализировали с помощью рестрикционного картирования (фиг. 5). Каждый последующий этап клонирования был аналогичен описанному ранее за исключением используемой пары праймеров. На втором этапе клонирования использовалась пара праймеров 2, 2 на третьем - 3,3, на четвертом - 4, 4. 11618 1 2009.02.28 Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая фрагменты нуклеокапсидного белка вируса гепатита Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 12