Штамм бактерий Rhizobium galegae БИМ В-437 Д для повышения урожайности Galega orientalis

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙБИМ В-437 Д ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Картыжова Лилия Евгеньевна Алещенкова Зинаида Михайловна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)2025472 С 1, 1994. ДОВНАР И.А. Приемы оптимизации технологии возделывания козлятника восточного (.). Автореферат диссертации. - Жодино,2003. - С. 14-15. ШЛАПУНОВ В.Н. и др. Земляробстваахова раслн. - 2003. -2. - С. 21-22. КАРТЫЖОВА Л.Е. и др. Защита растений. Сборник научных трудов. Вып. 30. Ч. . Стратегия и тактика защиты растений. Материалы научной конференции. - Минск, 2006. - С. 233237. КОЦЬ С.Я. и др. Микробиология и биотехнологиястолетия. Материалы международной конференции. Минск, 2002. - С. 236-237.(57) Штамм бактерийБИМ -437 Д, обладающий устойчивостью к углеводородам нефти, для повышения урожайности. Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и предназначено для повышения урожайности галеги восточной и восстановления почв, загрязненных нефтью. Известно использование природной накопительной культуры ризобий из измельченных корней 6-8 растений бобовых трав тех же видов после возобновления их вегетации из травостоев 2-3 года жизни путем смачивания их минеральной водой в количестве 1,52,0 л/га и смешивания их с гектарной нормой семян 1. Недостатком данного способа является использование для инокуляции семян бобовых трав спонтанной ризобиальной микрофлоры, не способной к созданию эффективного симбиоза с растением-хозяином. Известен штаммИПМ-215, обладающий фунгицидными свойствами и использующийся в способе приготовления бактериального удобрения на основе биогумуса (Способ приготовления бактериального удобрения на основе биогумуса) в концентрациях 1109 - 1 1012 спор на 1 кг биогумуса 2. Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков дополнительные расходы на прилипатели 13575 1 2010.08.30 дефицит азота требует дополнительного ввода микроорганизмов, обладающих способностью фиксировать азот из атмосферы. Известен штамм-2437 с титром 8107, использующийся в способе приготовления бактериального удобрения на основе биогумуса (Способ приготовления бактериального удобрения на основе биогумуса) 3. Недостатками данного изобретения являются трудоемкость способа (при достижении оптимальной (7,5) кислотности навоза) ненадежность стерилизации биогумуса после добавления мелассы в связи с использованием ватно-марлевых пробок для закрытия полипропиленовых пакетов в больших партиях бактериального удобрения может наблюдаться отсутствие точности при расфасовке биогумуса, и в связи с этим количество вводимой мелассы может не соответствовать необходимому содержанию для поддержания оптимального размножения клубеньковых бактерий. Маловероятно, что полученный таким способом биогумус будет включать в себя необходимое количество полезных микроорганизмов, в том числе и способных к фиксации азота. Известен спектр азотфиксирующих бактерий, используемых в способе культивирования азотфиксирующих бактерий (Способ культивирования азотфиксирующих бактерий) 4. Недостатком данного изобретения является то, что использование азотфиксирующей культуры бактерий не изучено в условиях интенсивного ведения сельского хозяйства,обусловленного применением пестицидов. Применение данного способа культивирования не изучено на специфичных штаммах, таких как . . Известен консорциум микроорганизмов, используемых в способе обезвреживания сточных вод, содержащих ароматические амины, активным илом (Способ обезвреживания сточных вод, содержащих ароматические амины, активным илом) 5. Локальная микробная очистка накапливающихся сточных вод основана на использовании высокоактивных штаммов микроорганизмов-деструкторов, более устойчивых к токсическому действию ингредиентов сточных вод. Консорциум микроорганизмов используется при очистке сильнозагрязненных сточных вод. Для фиторемедиации загрязненных нефтью почв использование этих высокоактивных микроорганизмов-деструкторов не изучено. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм, используемый в способе получения бактериального удобрения под галегу восточную (Способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода) 6. Данное изобретение предусматривает предварительное выращивание штаммов азотобактера на плотной питательной среде при температуре 26-28 С. Дальнейшее культивирование производят в среде Берка с добавлением экстракта кормовых дрожжей. Полученную накопительную культуру вносят в рабочий объем среды Берка с добавлением триптофана и экстракта кормовых дрожжей. Затем штаммы выращивают в ферментере на питательной среде Берка с добавлением триптофана и экстракта кормовых дрожжей. Дальнейшее выращивание штаммов проводят в ферментере на питательной среде Берка до концентрации клеток 108-109 кл./мл. Недостатки способа продолжительный период культивирования (48 часов) применение дополнительных компонентов в среде для стимуляции культуры экстракт кормовых дрожжей и триптофан многоэтапность производства получения препарата низкие титры культуры узкий спектр хозяйственно-полезных и экологически важных свойств (устойчивость к пестицидам, углеводородам нефти) у штаммов, являющихся основой бактериального удобрения отсутствие симбиоза с галегой восточной, а лишь стимуляция роста низкая рентабельность при производстве бактериального удобрения за счет трудоемкости приготовления среды и дороговизны ее компонентов. 2 13575 1 2010.08.30 Задача данного изобретения - получение штамма клубеньковых бактерий, обладающего комплексом хозяйственно-полезных и экологически важных свойств азотфиксация, ростстимуляция, устойчивость к пестицидам и углеводовородам нефти, способного к созданию высокоэффективного симбиоза с галегой восточной, и разработка технологических условий получения биопрепарата на его основе с целью инокуляции семян галеги восточной, возделываемой в условиях интенсивного земледелия и при загрязнении почв углеводородами нефти. Данная задача решается путем глубинного культивирования штамма клубеньковых бактерийБИМ -437 Д на питательной кукурузно-мелассной среде следующего состава,меласса - 0,5, кукурузный экстракт - 1,0, (4)34 - 0,05,6,5-7,0. Условия культивирования ферментер - АНКУМ-2 М, температура - 282 С, аэрация 1,0 объема воздуха на объем среды, время выращивания - 36 часов. Выделенный штамм клубеньковых бактерий, обладающий высокой степенью выживаемости, быстро размножающийся, колонизирующий корни., конкурентоспособный, обладающий высокой совместимостью и скоростью проникновения в корень, способен к образованию эффективных клубеньков на поверхности корня, с высокой азотфиксирующей активностью, обладающий устойчивостью к протравителям и углеводородам нефти (активно размножаясь, использует их как источник питания и энергии),является эффективным средством повышения урожайности галеги восточной в почвенноклиматических условиях Беларуси. Штамм клубеньковых бактерийБИМ -437 Д был выделен из клубеньков старовозрастных посевов галеги восточной сорта Нестерка, изучены его физиолого-биохимические свойства и определена эффективность микроорганизма в агроэкосистемах. Штамм непатогенен и депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси, где ему присвоен коллекционный номер БИМ В-437 Д. Характеристика штамма. Условия культивирования (поддержание) агаризованная бобовая среда, температура 26-28 С, хранится в пробирках при 4 С в течение 6 месяцев без пересева. Культурально-морфологические и биохимические свойства клетки штамма палочковидные, 7,22,6 мкм, окружены капсулой. При росте на бобовом агаре образуют округлой формы слизистые выпуклые колонии - бесцветные с явно выраженным центральным белого цвета точечным окрашиванием. Аэроб, в факторах роста не нуждается, титр при росте на бедных средах без источника углерода (-8) на 72 часах роста равен 3,90,12108 КОЕ/мл. Обладает способностью к кислотообразованию, используя углеводы-рибозу, -ксилозу, -маннозу, -галактозу, -арабинозу, -мальтозу, лактозу, дульцитол. При росте с дрожжевым экстрактом и манитолом через 3 суток размер колоний равен 4-6 мм. Оптимальная температура роста - 28 С, оптимальное значение 6,8-7,0, растет на безазотистой среде Эшби. ШтаммБИМ В-437 Д при росте на общепринятых средах не требует добавления витаминов и стартовых доз азота. Растет в бедных органических средах при 2,0 и 5,9, но не 6,1, и в присутствии 20 или более ,способен использовать -соединения в качестве единственного источника углерода, растет за счет использования н-алканов из 13-20 атомов углерода при культивировании совместно с нефтью и дизельным топливом в жидкой среде -8, фиксирует 2 в корневых клубеньках галеги восточной. Штамм не является патогенным и токсигенным. Токсикологические исследования штамма проводились на лабораторных животных - белых крысах массой 20-22 г и кроликах массой 2,5-3 кг. Установлено, что штамм при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении его суспензии в дозе 1,0-5,0109 КОЕ/мл/животное, а также интраназально - в дозе 109 КОЕ/мл/животное не вызывает у белых крыс клинических симптомов интоксикации 3 13575 1 2010.08.30 и гибели.БИМ -437 Д не обладает раздражающим действием на кожу при нанесении бактериальной суспензии на выбритый участок кожи кроликов размером 23 см в дозе 0,1 мл. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что штамм может использоваться в микробиологическом производстве, так как он не вызывает раздражающего действия, непатогенен и нетоксичен. Заявляемое изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами его конкретного осуществления. Пример 1. Подбор оптимальной питательной среды для роста и развития культуры клубеньковых бактерийБИМ -437 Д проводили методом глубинного культивирования на 3 различных по составу компонентов и способу предварительной подготовки питательных средах бобовой,гороховый отвар - 10,0 сахароза - 1,0 пищевой сахар - 1,07,2-7,6 агар-агар - 20,0 заводской,гороховый экстракт - 10,0, дрожжевой экстракт 0,05 сахароза - 0,5 глюкоза - 0,5 (4)24 - 0,05, 2432 - 0,025, 4720,020 7 кукурузно-мелассной,кукурузный экстракт - 1,0, меласса - 0,5, (4)24 0,05,7,4. Глубинное культивированиеБИМ -437 Д проводили в колбах Эрленмейера объемом 500 мл с 250 мл исследуемой питательной среды на лабораторной качалке (скорость вращения 200-220 об./мин) при температуре 26-28 С. Показатели ростаБИМ -437 Д на сравниваемых средах приведены в табл. 1. По результатам исследования для дальнейшей работы отобрана кукурузномелассная среда, обеспечивающая более высокий титр культуры-продуцента. Таблица 1 РостБИМ -437 Д на питательных средах различного состава при глубинном культивировании на качалке ТитрБИМ -437 Д, КОЕ/мл среды Среда культивирования 0 ч через 48 ч через 72 ч Бобовая среда (контроль) 2,220,08107 1,010,2109 5,50,6109 Заводская 3,00,03107 9,21,02108 4,60,36109 Кукурузно-мелассная 2,360,06107 1,30,08109 8,21,08109 Пример 2. Максимальный титр культурыБИМ -437 Д получен через 36 ч. глубинного культивирования на ферментере АНКУМ-2 М и составил - 8,7109 КОЕ/мл среды при 0,05 ч-1, максимальная скорость ростабыла отмечена через 6 ч культивирования и составила 1,33 ч-1, при которой период удвоения популяциисоставил 0,52 ч. Таблица 2 РостБИМ -437 Д при глубинном культивировании с различной концентрацией основных питательных компонентов Компоненты среды,Титры клетокБИМ -437 Д, от объема КОЕ/мл среды Меласса Кукурузный экстракт 0 ч через 24 ч через 36 ч 7 9 0,5 1,0 2,80,0310 4,00,810 7,730,46109 0,25 0,25 1,80,18107 3,20,32109 5,41,2109 0,12 0,25 2,00,06107 3,00,82109 5,20,8109 Увеличение содержания мелассы и кукурузного экстракта, вносимых в питательную среду, будет способствовать снижению рентабельности при получении и применении данного бактериального препарата в сельском хозяйстве. 4 13575 1 2010.08.30 Из приведенных данных следует, что получены по сравнению с прототипом ( - 108) наиболее высокие титры жизнеспособных клетокБИМ -437 Д 109-1010 при культивировании на кукурузно-мелассной среде при следующем соотношении компонентов,кукурузный экстракт - 1,0, меласса - 0,5, (4)34 - 0,05. Простота приготовления, доступность компонентов и их дешевизна - это аргументы, которые являются основанием для использования данной питательной среды для культивирования штамма. Пример 3. Отработка оптимального количества посевного материала, обеспечивающего высокий титр жизнеспособных клетокБИМ -437 Д. С этой целью колбы со стерильной средой засевали культурой в количестве 5, 10 от объема. В табл. 3 представлены данные, показывающие, что максимальный титр жизнеспособных клетокБИМ -437 Д получен при использовании 10 посевного материала. Через 48 ч культивирования на качалке титр культуры возрос на 2 порядка и был выше почти в 2 раза титра, полученного при использовании 5 посевного материала. Таблица 3 Влияние количества посевного материала на ростБИМ -437 Д на кукурузно-мелассной среде в условиях глубинного культивирования на качалке Титр клетокБИМ -437 Д,Количество посевного матеКОЕ/мл среды риала,от объема 0 ч 48 ч 7 5 1,50,0510 4,80,64109 10 2,90,09107 8,21,12109 Сокращение до 5(от объема) посевного материала не позволяет получить достаточной концентрации клеток, а дальнейшее увеличение (более 10 ) будет приводить к удорожанию процесса. Пример 4. Оптимизацию основных параметров культивированияБИМ -437 Д проводили в трех температурных режимах (20, 28, 35 С), при давлении 0,5 атм, скорости вращения мешалки 200-220 об./мин и расходе воздуха 1,0 и 2,0 объема на объем среды в минуту. В табл. 4, 5 приведены результаты влияния температуры и аэрации на ростБИМ -437 Д. Таблица 4 Влияние температуры культивирования на ростБИМ -437 Д в ферментере АНКУМ-2 М Титр жизнеспособных клетокБИМ -437 Д,КОЕ/мл среды Температура, С 0 ч 24 ч 36 ч 7 8 20 3,20,610 3,60,1210 6,01,02109 28 3,40,02107 4,60,32109 8,70,96109 35 3,60,08107 4,00,6109 8,00,84109 Таблица 5 Влияние интенсивности аэрации на ростБИМ -437 Д в ферментере АНКУМ-2 М Аэрация (объем возТитр жизнеспособных клетокБИМ -437 Д,духа/объем среКОЕ/мл среды ды/мин) 0 ч 24 ч 36 ч 7 8 2,0 3,20,1410 3,60,0810 5,20,27109 7 9 1,0 3,40,0810 4,60,1210 8,70,52109 5 13575 1 2010.08.30 Максимальный титр жизнеспособных клетокБИМ -437 Д получен при температуре 28 С и расходе воздуха 1,0 объема на объем среды. Пример 5. Реакцию штамма клубеньковых бактерийБИМ -437 Д на протравители семян фундазол, раксил и дивидент-стар и выживаемость на семенах определяли путем сравнительной оценки полученных титров культуры в вариантах опыта с контрольными данными (без протравителей) на агаризованной бобовой среде и жидкой при глубинном культивировании в колбах Эрленмейера объемом 500 мл с 250 мл, на лабораторной качалке (скорость вращения 200-220 об./мин) при температуре 26-28 С. Выживаемость штамма на протравленных семенах (в среднем от использования всех вышеуказанных протравителей) составила 80 . Применение дивидента-стар обеспечивает приживаемость и способствует стимуляции размножения штаммаБИМ -437 Д на семенах. По сравнению с контрольным вариантом приживаемость составила 107 , что в среднем на 39 выше, чем в вариантах с фундазолом и раксилом. Пример 6. При использовании галеги восточной в качестве фиторемедианта почв, загрязненных нефтью, актуальным вопросом является проверка микросимбионтов - штаммов клубеньковых бактерий, специфичных для конкретного растения-хозяина, способных инфицировать и создавать эффективный симбиоз с ним, на устойчивость к углеводородам нефти. В результате экспериментов было выявлено и изучено новое и неочевидное свойство нового штамма клубеньковых бактерий- устойчивость к углеводородам нефти(нефть, бензол, толуол, гексан, гексадекан, дизельное топливо, ксилол нефтяной). Поверхностный посев бактериальных суспензий штаммов клубеньковых бактерийпроводили на агаризованной бобовой среде методом лунок. У штаммаБИМ -437 Д отмечен сплошной рост по всей поверхности бобовой среды и вокруг лунки с исследуемыми углеводородами нефти. Установлено, что в присутствии углеводородов нефти у всех других штаммов клубеньковых бактерий,хранящихся в коллекции непатогенных микроорганизмов института микробиологии НАН Беларуси, в этих условиях отсутствует рост на агаризованной бобовой среде. Изучение роста и развития штаммаБИМ -437 Д совместно с углеводородами нефти в жидкой культуре проводили на среде -8 (г/л)- 0,5 4 - 0,8 24 0,7 (4)24 - 1,5 0,5 и 1,0 нефти и дизельного топлива в качестве единственного источника углерода. Глубинное культивированиеБИМ -437 Д проводили в колбах Эрленмейера объемом 500 мл с 250 мл исследуемой питательной среды на лабораторной качалке (скорость вращения 200-220 об./мин) при температуре 26-28 С. Показатели ростаБИМ -437 Д на сравниваемых средах приведены в табл. 7. Результаты эксперимента, приведенные в табл. показали, что через 72 ч культивирования максимальный титр жизнеспособных клетокБИМ -437 Д получен при внесении в среду 0,5 дизельного топлива и составляет 1,30,03109 КОЕ/мл, что на порядок выше, чем полученный в контроле (среда -8 без углеводородов) титр. При использовании 0,5 и 1,0 нефти титр культуры через 72 ч культивирования в жидкой культуре на порядок выше и составляет 1,4 и 1,5109 КОЕ/мл соответственно. 13575 1 2010.08.30 Таблица 7 РостБИМ -437 Д на среде -8 с углеводородами нефти при глубинном культивировании на качалке Часы культивирования Вариант опыта 0 24 48 72 Контроль 1,571,041010(исходный титр) Контроль (среда Е-83,50,56108 5,20,64108 1,09109 3,90,12108 0,5 сахарозы) 0,5 дизельного топлива 6,971,16108 2,50,08108 1,20,06109 1,30,03109 1,0 дизельного топлива 2,90,05108 4,80,32108 1,030,08109 3,30,05108 0,5 нефти 7,90,24108 6,60,08108 1,11,0109 1,40,08109 8 8 9 1,0 нефти 6,01,0810 7,71,210 1,70,0210 1,50,96109 Пример 7. Исследование азотфиксирующей и ростстимулирующей активности штаммаБИМ -437 Д проводили в полевых условиях, оценивая нодулирующую способность, высоту растений, выход урожая зеленой массы и его качество, прибавку к урожаю. Симбиотическую способностьБИМ -437 Д в симбиозе с галегой изучали по количеству образованных клубеньков. Таблица 8 Влияние инокуляции семян на формирование бобово-ризобиального симбиоза галеги восточной сорта Гале Высота Количество Количество Количество Масса клу- Масса растений активных Варианты клубеньков,клубеньков, беньков, корней, перед клубеньков,штук/1 раст. штук/м 2 г/м 2 г/м 2 уходом на штук/1 раст. зиму, см Контроль (без 9 2,9 547,3 31,6 обработки)-437 Д Почва со старопахотных 36 8,8 3132 9,4 634,2 48,4 посевов Согласно полученным данным (табл. 8), при анализе симбиотических показателей установлено, что применение штаммаБИМ -437 Д для инокуляции семян галеги восточной способствует созданию более эффективного симбиоза. Установлено, что за счет инокулянтаБИМ -437 Д стимулируется нодулирующая способность (количество активных клубеньков/1 раст., /м 2 г/м 2), высота растений и масса корней. По сравнению с применением почвенной суспензии в 1,8 раза возрастает количество активных клубеньков на 1 растение, что составляет 1914 штук/м 2, масса корней увеличивается на 197,9 г/м 2. Применение штамма стимулирует рост фитомассы дополнительно на 83 по сравнению с растениями без инокуляции. Пример 8. Показатели эффективности инокуляции семян галеги восточной. Прибавка урожая от применения препарата на основеБИМ -437 Д составила 231 ц/га (во второй год вегетации) при урожайности 638 ц/га, что составляет 7 13575 1 2010.08.30 157 от контрольной. По сравнению с использованием почвенного инокулюма прибавка к урожаю по зеленой массе составила 118 ц/га. Таблица 9 Урожайность зеленой массы галеги восточной (2 год жизни) при инокуляции семян разными видами инокулюма Урожайность Прибавка урожая Варианты опыта ц/га ц /га Опытное поле Подберезье Витебской области, сорт Гале Контроль, без обработки 407.БИМ -437 Д 638 231 108 Почва со старопахотных по 520 113 53 севов Пример 9. Показатели качества урожая. Благодаря инокуляции семянБИМ -437 Д продуктивность галеги восточной (ц/га кормовых единиц) по сравнению с контролем возрастает во второй год вегетации на 55 , что дополнительно обеспечивает 46 к.е./га. Содержание переваримого протеина увеличивается на 8,67 ц/га по сравнению с контролем (без инокуляции). Таблица 10 Продуктивность галеги восточной сорта Гале в зависимости от инокулянта Выход, ц/га Вариант опыта кормовых единиц переваримого протеина Витебская область, опытное поле Подберезье Контроль (без обработки) 81,6 11,80.БИМ -437 Д 127,6 20,47 Почвенная суспензия 104,0 15,13 Таким образом, предлагается специфичный в отношении растения-хозяина штамм клубеньковых бактерийБИМ -437 Д, способный создавать с. высоэффективный симбиоз и обладающий комплексом полезных и хозяйственно-ценных свойств (азотфиксирующей и ростстимулирующей активностями, устойчивостью к пестицидам и углеводородам нефти), используемый для предпосевной инокуляции семян. Таким образом, заявляемый штамм клубеньковых бактерийБИМ-437 Д обеспечивает следующие преимущества по сравнению с прототипом создание симбиоза с галегой восточной более высокие титры культуры в полученном препарате (на порядок выше по сравнению с прототипом) использование более технологичной среды (недорогие компоненты) полная замена азотных удобрений повышение урожайности и качества зеленой массы устойчивость к пестицидам и выживаемость на протравленных семенах устойчивость к углеводородам нефти - новое и неочевидное свойство заявляемого штамма. Источники информации 1. Патент 2000126444. 2. Патент РФ 2125549. 8 13575 1 2010.08.30 3. Патент 2286982. 4. Патент , МПК 7 226500005 11/08. 5. Патент 216609 1, МПК 602 3/00, 1/58, 1999. 6. Патент 3 2286324 1, МПК 05 11/08,12 1/20,12 1/065, 2006. 7. Хотянович В.А., Поздныкова А.И., Амстердамская Н.Ю. Производство торфяных препаратов клубеньковых бактерий. Тр. Всесоюз. Науч.-исслед. ин-т с.х. микробиол. СПб., 1980. Т.50. - С. 30-59. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9