Штамм бактерий Bacillus subtilis БИМ В-377-Д для защиты люпина от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙБИМ В-377-Д ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЛЮПИНА ОТ БОЛЕЗНЕЙ,ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Купцов Владислав Николаевич Коломиец Эмилия Ивановна Воронкова Анна Евгеньевна Евсегнеева Наталья Викторовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерийБИМ -377-Д для защиты люпина от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, может быть использовано при защите люпина от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, и касается нового штамма - основы биопестицида Легумин. Известен штамм 03 - основа американского биопрепарата ,предназначенного для защиты хлопка и зернобобовых культур от корневых гнилей 1. Обработка семян белого люпина биопрепаратом в сочетании с обработкой ипродионом обеспечивала более надежный контроль бурой пятнистости корней, чем обработка одним фунгицидом. Однако данный препарат не предназначен для защиты надземных частей растений, повреждение которых наносит гораздо больший ущерб посевам люпина по сравнению с корневыми гнилями. Известен штамм 153, продуцирующий водорастворимый антибиотик антифунгального действия. Штамм способен подавлять прорастание спор гриба, тем самым предохраняя растения от развития серой гнили 2. Известен штаммКМБУ 30043, используемый для защиты растений от фитопатогенных бактерий и грибов и, в частности, от серой гнили 3. Основными недостатками вышеперечисленных аналогов являются отсутствие антифунгальной активности к возбудителям наиболее вредоносных болезней люпина - грибами, а также потребность в дорогостоящих источниках углерода декстрозе и глюкозе для их глубинного культивирования. 9601 1 2007.08.30 Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению и достигаемому результату является штаммТх-1 для борьбы с фитопатогенными грибами и бактериями на двудольных и злаковых культурах 4. Данный штамм способен ингибировать рост фитопатогенных грибов - возбудителей серой гнили клубники и антракноза газонной травы. Данный штамм выбран в качестве прототипа. Недостатками штамма являются 1. Низкая антагонистическая активность в отношении грибови. 2. Отсутствие антифунгального действия в отношении гриба. 3. Низкая сохранность культуры при длительном хранении в связи с отсутствием спороношения. 4. Дорогостоящая питательная среда для глубинного культивирования. Задачей изобретения является получение штамма с высокой антагонистической активностью к возбудителям наиболее вредоносных болезней люпина, способного к росту и продукции антимикробных метаболитов на относительно дешевых и простых по составу питательных средах. Предлагаемый штаммБИМ В-377 Д выделен из дерново-подзолистой почвы Минской области, депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под регистрационным номером БИМ В-377 Д. Культура также поддерживается в коллекции лаборатории биометода защиты растений ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4 С на мясо-пептонном агаре, рН 6,8-7,2. Культурально-морфологические свойства При поверхностном культивировании на мясо-пептонном агаре образует серо-белые округлые колонии с ровным или чуть зубчатым краем поверхность гладкая, непрозрачная, матовая, сухая профиль плоский, консистенция вязкая. Клетки подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,7-0,81,0-1,3 мкм. Споры эллипсовидные, расположены центрально или субтерминально. Спорангий не раздут. Клетки расположены одиночно, в парах или коротких цепочках. Окраска по Граму положительная. Физиолого-биохимические признаки Облигатный аэроб. Растет при температуре 15-50 С. Оптимум 28-30 С. Отношение к источникам углерода утилизирует глюкозу, сахарозу, лактозу, манит,арабинозу, ксилозу, рамнозу, фруктозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, инозит, дульцит, сорбит, глицерин, цитрат разлагает казеин, разжижает желатин гидролизует крахмал, слабо утилизирует пропионат, не разлагает тирозин. Отношение к источникам азота ассимилирует сульфат аммония, нитрат аммония, нитрат калия, мочевину, пептон, кукурузный и дрожжевой экстракт, восстанавливает нитраты до нитритов. Другие особенности характеризуется каталазной активностью, образует ацетоин, растет на средах Мейнелла, Чапека, в 7 и не способен к росту при 10 концентрации. Штамм не является патогенным и токсикогенным. Токсикологические исследования штамма проводились на белых мышах. Установлено, что штамм при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении его суспензии во всех исследуемых концентрациях от 105 до 1010 не вызывает гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного покрова, двигательной активности опытных животных по сравнению с контрольными не выявлено. При введении фильтрата 7-суточной жидкой культурыБИМ В-377 Д подкожно в заднюю лапку в дозе 0,5 мл гибели опытных животных и некроза тканей на месте введения не выявлено. Проведенные исследования 9601 1 2007.08.30 позволяют сделать заключение, что штамм может использоваться в микробиологическом производстве. Штамм В.БИМ В-377 Д нефитотоксичен. Фитотоксичность проверяли на растениях люпина. Для проведения анализа семена люпина обрабатывали культуральной жидкостью бактерий. Контрольные проростки помещали в воду и стерильную питательную среду. После этого семена раскладывали в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу, помещали в термостат (24 С) и выдерживали несколько дней. Ингибирования развития проростков и образования некротических пятен и других изменений по сравнению с контролем не выявлено, что свидетельствует о нетоксичности бактерий В.БИМ В-377 Д для растений люпина. Штамм В.БИМ В-377 Д в опытахне ингибирует рост клубеньковых бактерий, что позволяет использовать его для обработки семян совместно с бактериальными удобрениями. Штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов,и. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Для изучения антифунгальной активности штамма В.БИМ В-377 Д бактерии высевают на картофельно-глюкозную агаризованную среду кольцом диаметром 40 мм,инкубируют 24 ч при 28 С. В центр сформировавшегося бактериального кольца засевают культуру фитопатогенного гриба, инкубируют при комнатной температуре 25 суток с периодическим учетом диаметра мицелия и количества образовавшихся на нем спор. Контролем во всех случаях служат чашки, засеянные чистой культурой гриба. Проведенные исследования (табл. 1) показали, что степень подавления роста мицелия фитопатогенных грибов штаммом В.БИМ В-377 Д в 1,7 - 1,8 раза превосходит таковую у прототипа Р.-1. Спорообразующая способность гриба В. , окруженного бактериальным кольцом В.БИМ В-377 Д, полностью подавлена, в то время как у известного штамма В.КМБУ 30043 3 она лишь снижена в 2,4 раза. Таблица 1 Подавление развития мицелия фитопатогенных грибов штаммом В.БИМ В-377 Д Степень подавления развития мицелия,Грибы В.БИМ В-377 Д.Тх-1 (прототип)100,0 58,3. 87,9 49,285,0 нет данных Таким образом, преимуществом заявляемого штамма В.БИМ В-377 Д по сравнению с прототипом является более высокая эффективность контроля возбудителей болезней люпина. Пример 2 Для оценки титра клеток, спор и антифунгального действия методом лунок бактерии В.БИМ В-377 Д выращивают в условиях глубинной ферментации в течение 48 ч при 28 С на питательной среде, основу которой составляют соли среды Мейнелла (г/л 2 НРО 43 Н 2 О - 7,0 Н 2 РО 4 - 3,0 47 Н 2 О - 0,1 (4)24 - 1,5 -цитрат - 0,5), а в качестве источников углерода используют мелассу - отход свеклосахарного производства. Культуральную жидкость объемом 100 мкл помещают в лунку (диаметром 8 мм) в агаризованной среде, предварительно засеянной спорами гриба В. . Чашки инкубируют 48 ч при 28 С и затем измеряют зоны подавления роста гриба. Согласно полученным данным (табл. 2) глубинная ферментация В.БИМ В-377 Д позволяет на дешевой питательной среде в течение 48 часов получать активную культуру, содержащую комплекс 3 9601 1 2007.08.30 антигрибных метаболитов, что соответствует времени культивирования прототипа Р.Тх-1 на дорогостоящем трипсино-соевом бульоне. Отличительной особенностью заявляемого штамма также является активное спороношение (1,5109 спор/мл), что положительно влияет на качество и сохранность препарата. Таблица 2 Основные показатели глубинного культивирования В.БИМ В-377 Д Титр Диаметр зон подавления фитопатогенов, мм Время, ч клеток спор В.С. зона отсутствия роста гриба б зона ослабленного роста гриба. Пример 3 С целью изучения антимикробных метаболитов бактерий В.БИМ В-377 Д проведено фракционирование этанольного экстракта супернатанта в экспериментально подобранных системах растворителей методом тонкослойной хроматографии. С помощью биоавтографии установлено, что антифунгальная активность штамма связана с фракцией 0,63 (метаболит 1). Наряду с этим у штамма В.БИМ В-377 Д выявлен водорастворимый антифунгальный фактор, остающийся после этанольной экстракции (метаболит 2). Методом лунок показано, что метаболит 1 образует чистую зону отсутствия роста гриба В.диаметром 16 мм, что соответствует размеру зоны, продуцируемой супернатантом известного аналога В.153. Однако существенным отличием заявляемого штамма В.БИМ В-377 Д является наличие второго метаболита, обладающего высокой диффузионной способностью в агаре и вызывающего ослабление роста воздушного мицелия и спорообразования гриба В.диаметром 50 мм и более. Оценка фитозащитного действия на проростках люпина выявила высокую биологическую эффективность обоих метаболитов. Таким образом, наличие вышеуказанных антифунгальных факторов дает возможность более полного контроля возбудителя серой гнили люпина на разных стадиях его развития. Пример 4 Оценка фитозащитного действия В.БИМ В-377 Д осуществлялась на проростках люпина узколистного. Для этого искусственно инфицированные возбудителями антракноза и серой гнили семена люпина обрабатывали 5 культуральной жидкостью антагониста. Фитоанализ 7-дневных проростков показал (табл. 2), что биологическая эффективность культуры в борьбе с серой гнилью ( ) на 18 выше эффективности штамма В.КМБУ 30043 (аналог) и составляет 90 . Наряду с этим заявленный штамм способен ослаблять развитие антракноза ( ) на 22 . Таблица 3 Оценка фотозащитных свойств В.БИМ В-334 Вид обработки семян Развитие болезни,Вода 0 В.100 В.В.-3 10 С.87 С.В.К-3 65 Таким образом, заявляемый штамм по важнейшим показателям - технологичности,спектру антимикробного действия и биологической эффективности превосходит прототип 4 9601 1 2007.08.30 и известные аналоги и может быть использован для защиты люпина от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами. Источники информации 1.,,,/ , . , . ,.// . - 1994. - . 84,10. - . 1114. 2. Патент 5753222, МПК А 01 63/00, 1998. 3. Патент 3962, МПК А 01 63/00, 2001. 4. Патент 6348193 1, МПК А 01 63/00, 2002. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5