Способ получения трехвидового тетраплоидного гибрида тритикале и ржи с межгеномной рекомбинацией хромосом

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕХВИДОВОГО ТЕТРАПЛОИДНОГО ГИБРИДА ТРИТИКАЛЕ И РЖИ С МЕЖГЕНОМНОЙ РЕКОМБИНАЦИЕЙ ХРОМОСОМ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Дубовец Надежда Ивановна Сычева Елена Анатольевна Соловей Лилия Алексеевна Штык Татьяна Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения трехвидового тетраплоидного гибрида тритикале и ржи с межгеномной рекомбинацией хромосом, при котором гибрид получают введением в геном двух гаплоидных филогенетически отдаленных компонентов генома из амфидиплоидной формы тритикале и одного диплоидного компонента из тритикале или диплоидной формы аллоплазматической ржи, причем диплоидный компонент является одинаковым в геномах тритикале и ржи, после чего поколение 1 выращивают в условиях свободного опыления,а в поколениях 2 и последующих осуществляют отбор трехвидовых тетраплоидных гибридов с межгеномной рекомбинацией хромосом с помощью метода дифференциального окрашивания хромосом. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к хромосомной инженерии и селекции растений, и может быть использовано для создания рекомбинантных тетраплоидных форм тритикале, сочетающих в одном из геномов генетический материал двух филогенетически отдаленных видов и являющихся посредниками для интрогрессии в культурные растения хозяйственно-полезных генов. Известен единственный способ, позволяющий получить межгеномные мейотические рекомбинации при интрогрессивной реконструкции генотипа современных сортов зерновых культур. Этот способ основывается на манипулировании генетической системой мейотического спаривания хромосом, что предполагает включение в скрещивания различных типов -мутантов (, , ) 1, 2. Как показано на фиг. 1, иллюстрирующей процесс создания рекомбинантных форм злаков с использованием -мутантных форм, в первый - третий годы проводят гибридизацию с целью получения замещенных линий, содержащих пары чужеродных хромосом. При этом если дополненная линия с добавлением желательной пары хромосом от филогенетически отдаленного вида или моносомная форма, используемые с этой целью, отсутст 13202 1 2010.06.30 вуют, необходимо провести предварительное их создание. Каждый из этапов этого процесса должен сопровождаться обязательным цитологическим анализом всего полученного потомства, что обуславливает высокую трудоемкость способа. Кроме того, гибриды 1 и 2 от скрещивания моносомной формы с дополненной линией характеризуются низкой цитологической стабильностью, жизнеспособностью и фертильностью, что уже на начальном этапе снижает эффективность применения данного метода. На четвертый год выделенные замещенные линии скрещивают с -мутантными формами пшеницы и получают гибридные семена, которые высевают в следующем году. Растения 1 самоопыляют с целью получения форм гомозиготных по -мутации. В последующих поколениях гибридов проводят отбор рекомбинантных форм. Недостатками данного способа являются большая продолжительность процесса (7-8 лет в случае наличия необходимых дополненных и моносомных линий злаков 10-11 лет,если требуется их предварительное создание), высокая трудоемкость получения замещенных линий и низкая эффективность выхода форм с межгеномными рекомбинациями. Следует отметить также, что генетическая система регуляции спаривания хромосом в мейозе(Р-система) в достаточной степени изучена лишь у пшеницы ( ). Поэтому описанный выше способ применяется для расширения генетической изменчивости только данной культуры. Цель изобретения - повышение эффективности процесса получения межгеномных рекомбинаций между филогенетически отдаленными геномами, сокращение сроков и упрощение способа создания рекомбинантных форм тритикале. Поставленная цель достигается тем, что, согласно предложенному способу, получение рекомбинантных форм основывается на создании трехвидовых тетраплоидных гибридов(АВСС, 24 х 28). Кариотип АВСС гибридов включает один диплоидный (базовый) геном (СС) и два различных гаплоидных генома (А и В), между которыми требуется получить межгеномные рекомбинации. Доминирование генетических систем базового генома стабилизирует кариотип, обеспечивая частичную фертильность гибридов и облегчая образование рекомбинаций между гаплоидными филогенетически отдаленными геномами (фиг. 2). Примечание буквенные обозначения геномов условные. Созданные трехвидовые тетраплоидные амфидиплоиды выращивают в условиях свободного опыления, ведут идентификацию и отбор форм с межгеномными хромосомными перестройками. Отличительной особенностью предлагаемого способа является синтез трехвидовых тетраплоидных (АВСС) гибридов, в составе которых доминирование регуляторных генетических систем базового диплоидного генома создает условия для спаривания и образования рекомбинаций между хромосомами филогенетически отдаленных геномов, находящихся в гаплоидном состоянии. Возможность реализации изобретения и эффективность использования предложенного способа подтверждаются результатами проведенных исследований, представленными в примерах 1 и 2. Пример 1. Скрещивали яровое тритикале 6 ТА 206 (, 26 х 42) с диплоидной аллоплазматической рожью на основе сорта Пролифик (, 22 х 14) (пример иллюстрируется фиг. 3). В первом поколении получили тетраплоидные трехвидовые гибриды(24 х 28), у которых диплоидный геном рживыступает в качестве базового, а филогенетические отдаленные А- и В-геномы, между которыми требуется получить рекомбинации, находятся в гаплоидном состоянии. Гибридные зерновки высевали, растения 1 и последующих поколений выращивали в условиях свободного опыления и проводили отбор форм с межгеномными рекомбинациями. Анализ кариотипов с целью выявления межгеномных рекомбинаций выполняли при помощи метода дифференциального окрашивания хромосом (С-бэндинг) 3. 2 13202 1 2010.06.30 Из данных таблицы видно, что из 18 проанализированных растений 2 кариотипы 4-х содержали транслокации между хромосомами А- и В-геномов по 2-й и 3-ей гомеологичным группам (22,2 ). Причем, как продемонстрировано на фиг. 4, в кариотипе одного растения присутствовали структурные перестройки одновременно по двум гомеологичным группам. Частота встречаемостирекомбинантных хромосом в разных гомеологичных группах тетраплоидных трехвидовых гибридов. Количество растений с межгеномными рекомбинациями, шт Комбинация Изучено скрещивания растений, шт из них по гомеологичной группе,всего 1 2 3 7 6 х-тритикале 6 ТА 206 х 18 4 0 75,0 50,0 0 2 х-рожь Пролифик, 2 6 х-тритикале 6 ТА 206 х 38 22 31,8 54,5 22,7 13,6 2 х-рожь Пролифик, 4 6 х-тритикале 6 ТА 472 х 30 11 72,7 45,5 36,4 0 2 х-рожь Пролифик, 3 В популяции 4 межгеномные рекомбинации были зафиксированы уже в хромосомах 1, 2,3 и 7-й гомеологичных групп и встречались в кариотипах 57,9 растений. Межгеномные перестройки в хромосомах 1-й гомеологичной группы показаны на фиг. 5. На фиг. 6 приведена метафазная пластинка дифференциально окрашенных хромосом трехвидового тетраплоидного гибрида 4, содержащего межгеномные рекомбинации одновременно в хромосомах 1 и 2-й гомеологичных групп. Места локализации межгеномных хромосомных перестроек на фиг. 4, 5 и 6 обозначены стрелками. Пример 2. Скрещивали яровое тритикале 6 ТА 472 (, 26 х 42) с диплоидной аллоплазматической рожью на основе сорта Пролифик (, 22 х 14) (схема гибридизации иллюстрируется фиг. 3). Полученные в 1 гибриды, как и растения последующих поколений, выращивали в условиях свободного опыления и вели отбор форм с межгеномными рекомбинациями. Анализ кариотипов на присутствие межгеномных рекомбинаций проводили согласно примеру 1. Проанализировано 30 гибридов. Как показано в таблице,частота растений с мейотическими рекомбинациями между хромосомами А- и В-геномов в целом по популяции 3 составила 36,6 от общего числа проанализированных гибридных форм. Межгеномные транслокации выявлены в хромосомах 1, 2 и 3-ей гомеологичных групп, что отражено на фиг. 7 (места локализации хромосомных перестроек обозначены стрелками). На фиг. 8 приводятся все варианты межгеномных рекомбинаций, полученные в ходе реализации изобретения в примерах 1 и 2 ( обозначает нормальную хромосому, Т - рекомбинантную хромосому). Предложенный способ значительно упрощает процесс получения форм тритикале с межгеномными рекомбинациями и сокращает на 2-3 года сроки их создания за счет исключения предварительного этапа синтеза замещенных линий и отсутствия необходимости проведения скрещиваний гибридных форм с Р-мутантами. Способ также повышает эффективность получения межгеномных рекомбинаций между филогенетически отдаленными геномами, о чем можно судить из сопоставления наших данных с имеющимися в литературе. Поскольку из литературных источников известно,что частота структурных перестроек, включающих хромосомы А- и В-геномов пшеницы,в растениях с мутациейдостигает 4,88 от общего числа проанализированных гибридов, а у форм с мутациеймежгеномные рекомбинации между этими геномами вообще не выявлены 4, то разница в эффективности между предложенным способом и прототипом составляет более 17,0 . Причем с каждым последующим поколением часто 3 13202 1 2010.06.30 та межгеномных рекомбинаций в популяции трехвидовых гибридов увеличивается, а их спектр расширяется. Кроме того, предложенный способ позволяет получить рекомбинантные формы злаков с межгеномными перестройками хромосом сразу по нескольким гомеологичным группам(проиллюстрировано на фиг. 4, 6, 7), в то время как прототип - только по одной определенной группе. Источники информации 1. Голубовская И.Н. Генетический контроль поведения хромосом в мейозе. Цитология и генетика мейоза / Под ред. И.И. Хвостовой, Ю.Ф. Богданова. - М. Наука, 1975. С. 312-343. 2. Цитогенетика пшеницы и ее гибридов / Под ред. П.М. Жуковского, В.В. Хвостова. М. Наука, - 1971. - 287 с. 3. Бадаев Н.С., Бадаева Е.Д., Большева Н.Л., Зеленин А.В. Идентификация хромосом А игеномов пшеницы с использованием замещений и перестроек между гомеологами у пшеницы и тритикале // Докл. Акад. наук СССР. - 1983. - Т. 273. -4. - С. 994-996. 4. - .,.,.-// . - 2001. - . 110. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8