Способ создания гомозиготных линий ржи

в связи с этим использование гетерозиса в работе с данными группами сортов малоэффективно. Наиболее полное проявление гетерозиса набшодается в гибридных сортах (гибридах).Для создания коммерческих гибридных сортов озимой ржи в качестве исходного материала необходимы гомозиготные линии.В настоящее время уже известен ряд способов получения гомозиготных линий у ржи.Первый способ - это проведение самоопыления (инбридинга) родоначальных растений в ряде поколений. Имеется два основных недостатка этого метода наличие у большинства растений ржи генетического механизма самонесовместимости и длительный период создания гомозиготных линий (обычно для этого требуется от 6 до 8, а иногда до 12 и более лет), причем даже при длительном инбридинге не удается добиться полной гомозиготности та или иная степень гетерозиготности сохраняется. Кроме того, у огромного числа потомств инцухтлиний с каждым циклом инбридинга наблюдается возрастание инцухт-депрессии(вследствие перехода ряда сублетальных, летальных и других рецессивных генов в гомозиготное состояние). Это происходит до тех пор, пока не наступит инбредный минимум. В результате значительная часть первоначального исходного материала теряется в ходе селекции 1.Известен способ получения гомозиготных линий методом гаплопродьюсера основанным на использовании скрещивания межвидовых скрещиваний элиминации хромосом продьюсера и последующего колхицинирования 1. Недостатками данного способа является трудоемкая технология получения, использование дорогостоящего оборудования и реактивов и крайне низкая эффективность, а также необходимость высокой квалификации сотрудников.Наиболее близким является способ, основанный на применении культуры пыльников 2 3,который предусматривает получение гаплоидных растений-регенерантов из пыльников, удвоение их набора хромосом и выращивание фертильных растений, однако, данный способ также является трудоемким, требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а также работы квалифицированного персонала, при этом следует отметить низкую его эффективность.Целью изобретения является повышение выхода гомозиготных линий при упрощении технологии их получения и сокращении сроков создания.В основу предлагаемого способа положено явление полиэмбрионии. Сущность способа состоит в следующем1. Из проращиваемых семян озимой ржи визуально выделяют проростки-близнецы.2. Сразу после выделения проростки колхицинируют а затем растения (Со) высаживают в почву (в горшочки для рассады) и помещают в прохладное место на рассеяный свет (до 2-х суток). Затем температуру воздуха и освещенность доводят до нормы.3. В фазе 2-3-х листьев проводят разделение растений-близнецов. Растения вновь высажи ваютв вегетационные сосуды. После того, как растения раскустятся, проводят клонирование в несколько этапов (по мере того как образуются побеги). По каждому клону (клон - это потомство вегетативно размноженного растения) желательно иметь не менее 10 частей растения.Клонирование проводят в теплице или в поле на специальном участке.4. яровизацию клопов проводят или в климокамере или в естественных условиях (в случае работы с озимыми формами ржи).5. В фазу выколашивания проводят цитологический анализ материнских клеток пыльцы на стадии мейоза. Анализировать желательно каждое растение каждого клона.б. Диплоидизированные гаплоиды подвергают самоопылению (до).7. В каждом клоне с растений обмолачивают семена (СЦ 1) отдельно.Настоящий способ позволяет получить исходные линии у различных форм ржи,обладающих как самоферггшгьностъю, так и самонСуществует несколько приемов преодоления самонесовместимости- использование пыльцы разного возраста.Контроль гомозиготности полученных линий проводят цитологическими и биохимическими методами, а также оценкой по потомству.Сохранность полученных линий обеспечивает микроклонированием, изолированным пересевом и длительным хранением семян.Реализация предложенного способа иллюстрируется на примере озимой ржи.Экспериментальное подтверждение метода растений-близнецов для получения гомозиготных диплоидизированныхгаплоидных линий с целью использования их при создании гетерозисных гибридных сортов озимой ржи.1) у озимой ржи существуют растения-близ нецы2) среди таких растений встречаются гаплоидные генотипы (п набор хромосом)3) среди сортов озимой ржи имеются различия как по частоте встречаемости растенийблизнецов, так и по частоте встречаемости гаплоидов среди растений-близнецов. Подобное утверждение справедливо и в отношении семей любого сорта озимой ржи4) из гаплоидов путем колхицинирования возможно создать диплоидизированные гаплоидные растения, а затем и самоопыленные линии.Из 19 сортообразцов озимой ржи (районированные сорта и селекционные номера) у одного не было найдено близнецов у девяти сортообразцов было найдено от 1 до 2 растений-близнецов у двух - от 5 до 6 близнецов, у двух - по 16 близнецов у двух - по 21 близнецу у одного - 39 близнецов и у двух сортообразцов - от 49 до 51 растения-близнеца.Таким образом, у 18 сортообразцов ржи частота встречаемости растений-близнецов варьировала от 0007 до 3,0.У одной гибридной популяции озимой ржи(селекционный номер 1460/ 86) была обследована 91 семья (по 565 подростков). Было выявлено, что в 72 семьях не обнаружено растений-близнецов в 9 ти семьях найдено по 1 близнецу (или 0,18 от числа проростков) в 3-х семьях - по 2 близнеца (0,35), в 4-х семьях - по 3 близнеца (0,53) еще в трех семьях - соответственно 4 близнеца (0,71),6 близнецов (1,06) и 12 близнецов (2,12).Всего в 1990 г. в октябре месяце было просмотрено 15 кг семян ржи (600000-700000 зерен). При этом было найдено 310 зерен,которые дали растения-близнецы (005 от числа всех изученных зерен). Таким образом из каждых 10000 зерен было найдено 1 зерно,обладающее полиэмбрионией.Растения-близнецы были разделены и высажены в грунт теплицы. После укоренения выжило 436 растений-близнецов разной плоидности (или 70,3 от числа всех генотиповблизнецов). Каждый генотип был расклонирован на 3-6-8-10 или 12 частей в зависшиости от степени кущения. По морфотипу мелкое строение органов, листьев, побегов - было выделено 186 клонов (а клон - это потомство вегетативно размноженного растения). Это составило 42,7 от числа всех клонов.Цитологический анализ растений показал, что они имеют гаплоидный набор хромосом.В январе все растения клонов были проколхицинированы и высажены вновь на укоренение в теплицу. Выжило 85 клонов (45,7 от числа обработанных колхицином).Колхицинирование растений ржи проводили в фазу кущения (растения погружались вРежим колхицинирования 7 часов экспозиции в 015 растворе колхшшна с добавкой 2 диметилсульфоксида и 0,З-ного раствора папаина 3-5 часов промывки в проточной водопроводной воде высадка в почву в прохладное (1518 С) затененное (до 2-х суток) место с относительной влажностью воздуха 60-80.В феврале растения всех клонов (по 3-12 растений в клоне) были пересажены в ящики с почвой и помещены в яровизационную камеру (4 С) на 65 дней. В мае месяце растения были пересажены в поле.При принудительном самоопьшении в полевых условиях растения 41 клона (48,2 из числа проявизированных), завязали зерно(Л). Было получено от 1 до 159 зерен на клон (004 - 12,0 зерен на каждый колос растения в клоне). Из этого количества часть растений 12 клонов (или 29,3 от числа озерненных клонов) обладали хорошей озерненностью колоса. Надо отметить, что как отдельные РЗСТСНИЯ, ТЗК И часть КОЛОСЬСВ у ОТДЕЛЬНЫХ растений оказались не озерненными.В конце лета семена от 41 клона (линии) были высеяны в поле. Семена 35 линий (или 85,4 от числа высеянных линий) оказались всхожими. Всхожесть составляла 87100 по каждой линии. Перезимовали все 35 линий. Перезимовка варьировала от 42,9 до 100.У 8 диплоидизированных линий по таким признакам, как форма куста, высота растений,характер выколашивания и форма коласа, поражаемость болезнями все растения были выравнены. Таким образом, косвенно эти линии можно характеризовать как гомозиготные.В ходе эксперимента , из 15 кг семян ржи (600-700 тыс.) было найдено 310 зерен, несущих в себе полиэмбрионию и давших проростки-близнецы. Из этих растений было получено 35 диплоидизированных гаплоидных линий (Или 11,1 от всех полиэмбриональных семян, или О,006 от всего количества проанализированных зерен). Следовательно, из каждых 100000 зерен озимой ржи можно найти гаплоидное растениебЛИЗНСЦ И ПОЛУЧИТЬ ИЗ НСГО ДИПЛОИДИЗИРО ванную гомозиготную фертильную линию.Исследования показали, что у удвоенных гаплоидов озимой ржи можно получить семена. Следовательно, полученные линии ржи можно сохранять и размножать. Однако, для сохранения гомозиготности линии необходимо применять инбридинг. Теоретически, если в генотипе у диплоидизированных растений линии есть ген самофертильности, то проблемы С ЗЗВЯЗЫВЗСМОСТЬЮ ССМЯН не ДОЛЖНО бЫТЬ. Однако, если такого гена нет, тогда надо вос 7 ВУ 1248 С 1 8пользоваться методом внутриклонового переопыления растений, а также повышением температуры воздуха до 30 С в период цветения, и таким образом преодолеть механизм самонесовместимости (т.е. возможно явление псевдосамофертильности). В дальнейшем,дштлоидизированные гаплоидгше гомозшотные лшши необходимо размножать при строгой пространственной изоляции, или же изолировать их под колпаками от чужеродной пыльцы. При этом в переопылении внутри линии участвуют все растения этой линии (в этом случае идет как бы перекрестное скрещивание и наличие или отсутствие в генотипе гена самофертильности теоретически не должно играть роли). У диплоидизированной юмозиготной линии расщепления по какому-либо признаку быть не должно (так как при создании подобной линии в результате колхициъщрования гаплоидного организма все аллели - и доминантные и рецессивные - переходят в гомозиготное состояние). Изменение гомозиготности и появление гетерозигот может быть вызвано только мутациями или гибридизацией.Полученные настоящим способом линии предназначены для получения семян гибридов первого поколения с использованием гаметоцидов, а также при различных селекционно-генетических исследованиях.Возможность использования в практике селекции полученных линий показана нижеКраткий цикл получения коммерческих семян гибридов первого поколения озимой ржи- 1-й год поиск растений-близнецов и получение юмозиготных гаплоидных линий- 4 - 8-й годы - получение первых гетерозисных гибридов (с применением гаметоцидов) и их испытание- 9-й и последующие годы - получение семян (171) коммерческих гибридов и их реализация. Организация первичного семеноводства родительских компонентов.Расширенная схема селекции гибридных(коммерческих) сортов озимой ржи Схема селекции опирается на применение гомозиютных линий озимой ржи, обладающих высокой общей специфической комбинационной способностью (ОКС и СКС). Линии получают по методу близнецов. Гибридизация осуществляется при помощи гаметоцидов. Схематично процесс показан на рисунках 1-7. Комментарии к рисункам1-й год (рис. 1) При поиске растений-близнецов и получении диплоидизированных гаплоидных линий (ДГЛ)- цитологический анализ мощности растений близнецов- тест на гомозиготность (электрофорез семян 11).1. При разложении линий (позиция 3) проводят контроль гомозиготности по морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам. Электрофорез проводят на 1-2 зернах с каждого растения.Размножение проводят самоопылением растений под индивидуальными изоляторами(при наличии системы самофергильности), переопылением нескольких растений ДГЛ под общим изолятором или выращиванием ДГЛ на пространственно-изолированных участках.2. Испытание ДГЛ на иммунитет (позиция 4) проводят в лабораторных и полевых условиях на искусственно инфицированных фонах. Для теста по каждой болезни высевают 5 зерен ДГЛ.З. Для определения комбинационной способности закладывают питомник топ-кросса(позиция 5) или питомник диаллельных скрещиваний (позиция 6).В питомнике топ-кросса (позиция 5) предусматривают 2 тестера лучшая по продуктивности ДГЛ и районированный сорт или смесь семян всех испытываемых ДГЛ.Часть семян топкроссовых гибридов оставляют в резерве (позиция 8). Остальная часть идет на следующий год в питомник испытания топ-кроссовых гибридов (позиция 9).Из питомника диаллельных скрещиваний(позиция 6) семена диаллельных гибридов 171 поступают на следующий год в питомник испытаний (позиция 10).4. Для оценки продуктивности ДГЛ закладывают селекционный питомник (позиция 7). Для посева требуется 160 зерен от каждой линии на трехрядковую делянку длиной 1 м. При оценке определяют массу 1000 зерен, продуктивность колоса, выровненность колосьев и другие хозяйственно-ценные признаки, такие как число падения и удельная масса зерна,различные биохимические показатели. Дают иммунологическую характеристику линий на естественном фоне. По результатам этой оценки из семян, находящихся в банке хранения(позиция 2), формируют популяцию синтетик и на следующий год закладывают питомник переопыления И первый цикл отбора лучших злит (позиция 11). Общая масса ссмян переопыленных растений всех линий в селекционном питомнике (позиция 7) может служить новым источником растений-близнецов.Позиции 3, 4, 5, 6 и 7 проводят в последующем ежегодно. Семена для этих позиций берут из банка семян линий (позиция 2).1. Для оценки общей комбинационной способности (ОКС) и специфической комбинационной способности (СКС) закладывают питомник испытания топ-кроссовых гибридов Р 1 (позиция 9) и питомник испытания гибридов 171 от диалельных скрещивании (позиция 10). При этом оба вида питомников желательно закладывать в нескольких местностях (для выявления экологического влияния на урожайность гибридов Р 1).2. Синтетическая популяция из лучших по продуктивности ДГЛ (позиция 11) может служить источником новых растений-близнецов. В этом питомнике проводят свободное переопыление и отбор элитных растений. Семена для закладки позиции 11 берут из банка семян линий (позиция 2).1. По результатам испытаний гибридов Р 1 от диаллельных скрещиваний и топ-кросса выЯВЛЯКУГ ЛИНИИ, КОТОРЫС МОГУТ СЛУЖИТЬ МЗТС РРНСКИМИ ИЛИ ОТЦОВСКИМИ КОМПОНСНТЗМИ ДЛЯ скрещивания.Для получения перспективных гибридов Р 1 ЗЗКЛЗДЫВЗЮТ НССКОЛЬКО ПИТОМНИКОВ гибридизации (позиция 12). Питомники гибридизации должны быть пространственно изолшрованы друг от друга И от любых других посевов ржи. Семена для закладки питомников гибридизации берут из банка хранения (позиция 2).2. На основе результатов испытаний, из лучших топ-кроссовых гибридов 171 формируют популяцию-синтетик и закладывают питомник отбора (позиция 13). Семена для этой цели берут из резерва топ-кроссовых гибридов 171(позиция 8). Сформированная популяция-синтетик может служить базой для поиска новых растений-близнецов.3. Из лучших элитных растений синтетической популяции (позиция 11) закладывают питомник свободного переопыления 2-го года (позгщия 14). В дальнейлгем рекуррентная популяция можетслужить новым источником растений-близнецов, а также перспективным сортом-синтетиком. Позиции 12, 13 и 14 проводят ежегодно.1. Закладывают питомник конкурсного испытания гибридов Р 1, полученных при помощи гаметоцидов, сортов-синтетиков и сортов-популяций в сравнении со стандартным районированным сортом (позиция 15).2. Закладывают экологическое сортоиспытание перспективных и районированных гибридных сортов, сортов-синтетике) И сортов-популяций (позиция 16). Экологическое сортоиспытание закладывают в различных по ПОЧВСННО-КЛИМЗТИЧВСКИМ УСЛОВИЯМ МЕСТНОстях.Семена для закладки конкурсного и экологического сортоиспытаний берут из питомника гибридизации (позиция 12), питомника отбора 1-го года (позиция 13) И питомника свободного переопыления 2-го года (позиция 14).3. Родительские компоненты перспективных гибридных сортов должны быть размножены в достаточном количестве на пространственноизолированных участках (позиция 3).1. По результатам конкурсного и экологического сортоиспытаний перспективные гибриды Р передают в государственное сортоиспытание (позиция 19).2. Одновременно с передачей перспективных гибридов Р в государственное сортоиспытание закладывают несколько питомников размножения родительских компонентов этих гибридов(позиции 17 и 18). Семена для этого берут в банке семян линий (позиция 2).Позиции 17, 18 И 19 в дальнейшем проводят по мере необходимости.По предварительным результатам государственного сортоиспытания (1-2-х летние данные) закладывают промышленные питомники гибридизации С ПРИМСНСНИСМ ГЗМСТОЦИДОВ(позиция 20) для получения семян 171 (перспективного или районированного) гибридного сорта с целью накопления запаса семян Р 1 для последующей реализации. Семена компонентов берут из питомников размножения этих линий (позиции 17 и 18).В дальнейшем позиции 17, 18, 19 и 20 проводят ежегодно, пока гибридный сорт находится в районировании и пользуется спросом.