Способ диагностики состояния Т-системы иммунитета у больного вирусным гепатитом В, С или микст-гепатитом В+C

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ Т-СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНОГО ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ В, С ИЛИ МИКСТ-ГЕПАТИТОМ В(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Титов Леонид Петрович Тарасюк Владимир Васильевич Черношей Дмитрий Александрович Жмуровская Людмила Степановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Способ диагностики состояния Т-системы иммунитета у больного вирусным гепатитом В, С или микст-гепатитом ВС, заключающийся в том, что определяют в периферической крови количество лимфоцитов с маркерами 11, 25, - и 95 и, если отношение лимфоцитов 95 к 11 составляет 2,080,08, 95 к 25 составляет 2,140,31 и 95 к - составляет 1,930,22, диагностируют нормэргию Т-системы иммунитета, а при более высоких значениях этих отношений - анергию Т-системы иммунитета. Изобретение относится к области медицины, в частности к способам исследования иммунной системы, и может быть использовано для диагностики функционального состояния клеток Т-системы иммунитета у больных вирусными гепатитами В (ВГВ), С(ВГС) и микст-гепатитом ВС (МГВС). Известен способ исследования Т-звена иммунитета путем постановки внутрикожных тестов с антигенами и/или митогенами 1. Недостатками известного способа являются его трудоемкость, инвазивная процедура,недостаточная информативность вследствие неполной дифференциации типа реагирования иммунной системы на используемые митогены и невысокая точность (субъективность полученных результатов). В качестве прототипа выбран способ диагностики состояния Т-системы иммунитета при различной иммунопатологии, заключающийся в иммунофенотипировании клеток периферической крови методом проточной цитометрии или иммунофлюоресцентным мето 11965 1 2009.06.30 дом с целью определения поверхностных маркеров на мембране иммунокомпетентных клеток (ИКК) 2. Недостатком вышеизложенного способа является трудность интерпретации полученного результата без учета взаимосвязи между определенными отдельно функциональными показателями клеток Т-системы иммунитета. Обычное определение экспрессии данных рецепторов на ИКК является менее информативным при имеющихся нарушениях. Задачей настоящего изобретения является создание более эффективного способа, а именно повышение точности и информативности известного способа, диагностики состояния Т-системы иммунитета у больных ВГВ, ВГС и МГВС. Поставленная задача решается за счет того, что в способе диагностики состояния Т-системы иммунитета у больного вирусным гепатитом В, С и микст-гепатитом ВС,заключающемся в том, что определяют в периферической крови количество лимфоцитов с маркерами 11, 25, - и 95 и, если отношение лимфоцитов 95 к 11 составляет 2,080,08, 95 к 25 составляет 2,140,31 и 95 к составляет 1,930,22, диагностируют состояние нормэргии Т-системы иммунитета, а при более высоких значениях этих отношений - анергию Т-системы иммунитета. Отношение (индекс) 95 к 11 определяет адгезивную способность ИКК, а отношения 95 к 25 и 95 к - характеризуют этапы ранней активации(процессы секреции и рецепции цитокинов) и поздней активации (дифференцировка ИКК). Таким образом, предложенные индексы позволяют оценить вклад каждого этапа активации в исход развития клеточного иммунного ответа. По полученным результатам констатируют позитивную или негативную клеточную активацию. Позитивная активация представляет собой нормально происходящий процесс активации Т-лимфоцитов, завершающийся осуществлением их эффекторной функции. Негативная активация приводит ИКК к апоптозу, минуя эффекторную фазу, что существенно ограничивает протективные возможности ИКК и приводит к формированию состояния анергии иммунной системы при различной иммунопатологии 3. При повышении этих индексов - состояние анергии,т.е. состояние специфической неотвечаемости Т-системы иммунитета, что обусловлено развитием иммунного ответа по пути апоптоза (негативная активация). Способ осуществляют следующем образом забирают кровь из периферической вены(5-6 мл) в пробирки с гепарином (20 ЕД/мл), выделяют мононуклеары периферической крови (МПК) методом градиентного центрифугирования или иммунофенотипирование проводят в цельной крови. Экспрессия 11, 25, - и 95 антигенов на МПК определяется в реакции иммунофлюоресценции с помощью соответствующих моноклональных антител согласно инструкции производителя. Так, к 100 мкл МПК (1,0106/мл) или цельной крови добавляют 5-20 мкл соответствующего раствора моноклональных антител и инкубируют в течение 15-30 мин. Затем, в случае с выделенными МПК, проводят двойную отмывку фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и ресуспензируют в 300-500 мкл 1 раствора параформальдегида для фиксирования. В случае с цельной кровью после взаимодействия с моноклональными антителами добавляют лизирующий раствор по 2 мл и инкубируют в темноте в течение 10 мин с последующей двойной отмывкой ФСБ и ресуспензированием в 300-500 мкл 1 раствора параформальдегида. Учет реакции производится на проточном цитофлюориметре или люминесцентном микроскопе с последующим определением относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих изучаемые поверхностные антигены. Затем рассчитывают соотношения относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих маркер апоптоза(95), к относительному или абсолютному количеству клеток, экспрессирующих маркеры адгезии (11), ранней (25) и поздней активации (-) 1) 95/11, 2) 95/25 и 3) 95/-. 11965 1 2009.06.30 Значения индексов 95/11, 95/25 и 95/- у практически здоровых людей, свидетельствующие о состоянии нормэргии Т-системы иммунитета,представлены в таблице. Соотношения клеток, экспрессирующих маркеры адгезии, активации и апоптоза, в норме и при ВГС, ВГВ, МГВС Контрольная Группы больных Индексы группа ОГВ ХГВ ОГС ХГС МГВС 95 /11 2,080,08 1,900,1 2,500,13 2,170,22 2,760,33 2,290,24 95/25 2,140,05 5,000,58 5,120,96 4,240,58 6,230,92 4,380,53 95/- 1,930,06 2,580,28 2,960,28 3,150,32 3,640,38 3,120,56 Примечание- Р 0,05- Р 0,1. При ВГВ, ВГС и МГ выявлено значительное увеличение данных индексов по сравнению с таковыми в контрольной группе (Р 0,05), что указывает на состояние анергии(таблица). Повышение данных соотношений свидетельствует о пониженной адгезивной и активационной способности Т-лимфоцитов на фоне высокой готовности их к процессам апоптоза, приводящим к повышенной и неправильной активации ИКК и развитию иммунного ответа по пути апоптоза (негативная активация), что способствует формированию вирусоспецифической анергии Т-системы иммунитета и неэффективности противовирусного ответа при данной патологии. Наличие состояния анергии иммунной системы лежит в основе хронизации и персистенции - и -инфекций. Способ подтверждается примерами 1. Больной А., 28 лет, история болезни 1499, дата госпитализации 24.04.2000. Поступил в инфекционную больницу на 10 день болезни с клиническими признаками острого вирусного гепатита. После биохимического и серологического обследования установлен диагноз Острый гепатит С (-), желтушная среднетяжелая форма. Результаты лабораторного обследования. При поступлении. Биохимический анализ крови (БАК) билирубин общий - 154,0 (прямой (пр.) - 90,2) мкмоль/л, АлАТ - 40,5 ммоль/ч/л, тимоловая проба (ТП) - 1,1 ед. Общий анализ крови (К) лейкоциты- 5,6109/л лимфоциты (л) - 33 . Фенотипические параметры ИКК 3 - 71,98(1,33109/л), 4 - 33,06(0,77109/л), - - 9,57(0,18109/л). При расчете 95/11, 95/25 и 95/- выявлено состояние анергии 95/11 - 2,27 95/25 - 6,54 95/- - 4,36. Проводимое симптоматическое лечение способствовало улучшению состояния больного и снижению симптомов интоксикации. При повторном обследовании (20 сутки болезни). БАК билирубин общий - 69,5 (пр. 48,8) мкмоль/л, АлАТ - 34,5 ммоль/ч/л, ТП - 1,6 ед. К- 7,8109/л л - 34 . Фенотипические параметры ИКК 3 - 60,03(1,59109/л), 4 - 20,55(1,24109/л), - - 6,25(0,17109/л). Несмотря на положительную клинико-лабораторную динамику, рассчитываемые соотношения клеток имели тенденцию к повышению (95/11 - 2,90 95/25 13,59 95/- - 7,50) и сохраняли анергический характер. Это свидетельствует о состоянии анергии Т-системы иммунитета, возможном неблагоприятном исходе острого гепатита С и последующей хронизацией процесса. 3 11965 1 2009.06.30 Последующее диспансерное наблюдение за больным после выписки из стационара подтвердило развитие хронического гепатита С. 2. Больной Т., 41 год, история болезни 1462, дата госпитализации 20.04.2000. Хронический гепатит С установлен в 1998 г., когда впервые были выявлены . Поступил в инфекционную больницу для обследования и уточнения активности инфекционного процесса. Жалоб на момент осмотра не предъявлял. Результаты лабораторного обследования. БАК билирубин общ. - 24,4 (пр. - нет) мкмоль/л, АлАТ - 1,8 ммоль/ч/л, ТП - 9,2 ед. К 26.04.2000- 4,6109/л л - 39 , п - 8 , с - 45 , м - 6 , э - 2 , СОЭ - 8 мм/ч. 08.05.2000- 4,9109/л л - 30 . Установлен хронический гепатит С (-) клинико-биохимически минимальной степени активности. Фенотипическая характеристика ИКК проведена дважды с интервалом в 2 недели 26.04.2000 г. - 3 - 76,89(1,38109/л), 4 - 43,08(0,77109/л), 8 - 46,88(0,36109/л) 08.05.2000 г. - 3 - 80,17(1,18109/л), 4 - 40,22(0,59109/л),8 - 26,54(0,39109/л), 11- 14,0(0,21109/л), 16 - 10,07(0,15109/л),20 - 6,67(0,10109/л), 25 - 7,24(0,11109/л), 95 - 48,0(0,71109/л),- - 13,43(0,20109/л). Соотношения клеток, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза, свидетельствуют о состоянии анергии иммунной системы при поступлении - 95/11 - 1,95,95/25 - 5,29, 95/- - 2,62 на 12 сутки - 95/11 - 3,42,95/25 - 6,63, 95/- - 3,57. 3. Больной М., 25 лет, история болезни 493, дата госпитализации 06.02.2000. Поступил в инфекционную больницу на 14 день болезни с жалобами на боль в животе,тошноту, рвоту, желтуху на коже и видимых слизистых, холурию, ахолию. Установлен диагноз Микст-гепатит Острый гепатит В (, -),желтушная среднетяжелая форма на фоне хронического гепатита С (-). Результаты лабораторного обследования. При поступлении. БАК билирубин общий - 180,4 (пр. - 96,4) мкмоль/л, АлАТ 42,0 ммоль/ч/л, ТП - 8,4 ед. К- 8,5109/л л - 24 , п - 9 , с - 51 , м - нет, э - 5 ,СОЭ - 2 мм/ч. Фенотипические параметры ИКК 3 - 61,02(1,24109/л), 4 - 11,77(0,69109/л), - - 10,22(0,21109/л). Расчет соотношений клеток, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза, выявил состояние анергии Т-системы иммунитета 95/11 - 2,43 95/25 - 7,39 95/- - 3,29. После проведенного лечения (дезинтоксикационная терапиягепатопротекторы) в удовлетворительном состоянии больной выписан. При выписке. БАК билирубин общ. - 31,9 (пр. - нет) мкмоль/л, АлАТ - 2,5 ммоль/ч/л,ТП - 2,2 ед. К- 7,8109/л л - 51 , п - 4 , с -34 , м - 5 , э - 3 , СОЭ - 4 мм/ч. Фенотипические параметры ИКК 3 - 58,14(2,31109/л), 4 - 36,04 11965 1 2009.06.30 Соотношения сохранили высокие цифры (95/11 - 2,46 95/25 - 8,01 95/- - 3,74), что может указывать на активизацию хронического гепатита С(дальнейшее угнетение функции иммунной системы) после улучшения клиникобиохимических показателей острого гепатита В. Последующее диспансерное наблюдение за больным через 6 месяцев выявило-,, ДНК -, -, РНК . 4. Больной С., 16 лет, история болезни 5105, дата госпитализации 01.12.1999. Поступил в инфекционную больницу на 6 день болезни с жалобами на боль в животе,тошноту, рвоту, желтуху на коже и видимых слизистых, холурию, ахолию. Установлен диагноз Острый ВГВ (, - ), тяжелое течение. Результаты лабораторного обследования. При поступлении биохимический анализ крови (БАК) билирубин общий 236,2 мкмоль/л, АлАТ - 58,2 ммоль/ч/л. Общий анализ крови (К) лейкоциты 6,2109/л лимфоциты (л) - 48(6,2109/л). Фенотипические параметры иммунокомпетентных клеток (ИКК) 3 - 60,8(0,38109/л), 95 - 27,7(0,83109/л), - - 13,95(0,42109/л). Значения индексов апоптоза (95/11 - 2,14 95/25 - 2,18 и 95/- 1,99) диагностировали состояние нормэргии. После проведенного лечения (дезинтоксикационная терапиягепатопротекторы) и улучшения клинико-биохимических показателей острого ВГВ пациент был выписан в удовлетворительном состоянии. При выписке значения индексов апоптоза практически не изменились (95/11 - 2,16 95/25 - 2,1 95/- - 1,9), указывая на развитие адекватного противовирусного ответа Т-системы иммунитета (состояние нормэргии). 5. Больной У., 18 лет, история болезни 1037, дата госпитализации 17.03.1999. Поступил в отделение вирусных гепатитов ГИКБ г. Минска на 7 день болезни с клиническими признаками острого гепатита 4-й день желтушного периода с жалобами на слабость, отсутствие аппетита, тошноту, плохой сон, боль в области правого подреберья,жидкий стул. После биохимического и серологического обследования установлен диагноз Острый гепатит С (анти-НС, РНК ), среднетяжелая форма. Результаты лабораторного обследования. При поступлении. БАК билирубин общий - 169,2 (прямой (пр.) - 109,4) мкмоль/л,АлАТ - 22,5 ммоль/ч/л, тимоловая проба (ТП) - 3,2 ед. К- 7,6109/л л - 34(2,58109/л). Фенотипические параметры ИКК 3 - 71,6(1,85109/л), 4 - 45,5(1,13109/л), - - 11,34(0,29109/л). При расчете 95/11, 95/25 и 95/- выявлено состояние анергии 95/11 - 4,40 95/25 - 5,28 95/- - 3,85. Проводимое этиопатогенетическое и симптоматическое лечение способствовало улучшению состояния больного и снижению симптомов интоксикации. При повторном обследовании (30 сутки болезни) БАК билирубин общий - 22,7 (пр. нет) мкмоль/л, АлАТ - 2,1 ммоль/ч/л, ТП - 1,3 ед. К- 5,9109/л л - 45(2,66 109/л). Фенотипические параметры ИКК 3 - 64,4(1,71109/л), 4 - 36,37(0,71109/л), - - 14,03(0,37109/л). Рассчитываемые соотношения клеток имели тенденцию к снижению (95/11 2,02 95/25 - 2,19 95/- - 1,89) и соответствовали состоянию нормэргии. На фиг. 1 отображены значения 95/25 индекса у больных ВГС и МГВС. Пиком кривых являются средние значения данного индекса концы кривой - значения его доверительных интервалов. Поскольку степень функциональной неполноценности ИКК периферической крови является признаком патогенетически значимого дефекта(ов) иммунного ответа и перспективным прогностическим критерием хронизации инфекций, то индексы апоптоза при ВГС и МГВС, позволяя выявлять повреждения молекулярноклеточных механизмов функциональной активности Т-клеток, могут быть использованы для мониторинга (прогноза) течения заболевания (фиг. 1). Так, среднее значение 95/25 индекса у больных ХГС значительно превышало таковой у больных ОГС и МГВС (Р 0,05). Оценивая значения доверительных интервалов данного индекса, предел(- ) 95/25 для прогноза течения заболевания составил 4,75. Это свидетельствует, что наиболее выраженная анергия иммунной системы (нарушение этапа секреции/рецепции цитокинов) характерна для хронических гепатитов. При анализе 95/- и 95/11 индексов такая зависимость была незначительной(Р 0,05). На фиг. 2 приведены значения 95/25, 95/- и 95/11 - индексов у больных ОГС (А), ХГС (Б) и МГВС (В) в зависимости от формы тяжести (ФТ) и степени активности (СА) заболевания. Обозначениесвидетельствует о достоверности различий показателей в сравнении с аналогичными в контрольной группе и равна Р 0,05. Увеличение индексов ассоциировалось с выраженностью цитолитического синдрома, что позволяет их использовать для прогноза течения заболевания (фиг. 2). У больных ОГС с легкой формой 95/25 и 95/- индексы значительно выше (Р 0,05) по сравнениютаковыми в группе больных ОГС с тяжелой формой заболевания (фиг. 2-А). Диагностическая значимость данных индексов для прогноза(диагностики) тяжести заболевания больных ОГС была следующей -для 95/25 составил 3,17 при чувствительности - 0,71 и специфичности - 0,42 для 95/- составил 2,87 при чувствительности - 0,60 и специфичности 0,59. При этом прогностическая ценность положительного результата данных индексов равна 59 и 58,3 соответственно, а прогностическая ценность отрицательного результата - 44 и 41,7 соответственно. Значение 95/11 индекса не изменялось в зависимости от формы тяжести заболевания. У больных ХГС значения индексов были значительно выше у больных с высокой клинико-биохимической степенью активности заболевания (фиг. 2-Б). Однако значение 95/25 индекса было также увеличено и у больных с умеренной клиникобиохимической степенью активности. Диагностическая значимость данных индексов для оценки клинико-биохимической степени активности у больных ХГС была следующей-для 95/25 составил 2,94 при чувствительности - 0,75 и специфичности - 0,39 -для 95/- равен 2,90 при чувствительности - 0,54 и специфичности - 0,41 -для 95/11 составил 2,89 при чувствительности - 0,30 и специфичности - 0,68. Прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов для индексов равна 62,1 и 46,2 соответственно. У больных МГВС со среднетяжелой и тяжелой формой значения 95/25 и С 95/НА- - индексов были значительно выше, чем у больных с легкой формой(фиг. 2-В). Диагностическая значимость данных индексов для оценки для прогноза (диагностики) тяжести заболевания у больных МГВС была следующей -для 95/25 составил 2,87 при чувствительности - 0,80 и специфичности - 0,37 6 11965 1 2009.06.30 для 95/- - 2,43 при чувствительности - 0,44 и специфичности - 0,56. При этом прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов равна 52 и 38 соответственно. Значение 95/11 индекса также было увеличено только у пациентов с тяжелой формой. -для 95/11 составил 2,67 при чувствительности - 0,60 и специфичности - 0,20 (прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов равна 52 и 38 соответственно). Следовательно, наличие состояния анергии иммунной системы чаще наблюдается у больных ОГС с легкой формой тяжести, а у больных ХГС и МГВС с высокой активностью и тяжелой формой тяжести болезни соответственно. При этом в последнем случае анергия иммунной системы обусловлена нарушением всех трех фаз активации ИКК (межклеточная адгезия, секреция/рецепция цитокинов, поздняя активация и дифференцировка). У больных ХГС и МГВС с умеренной активностью и среднетяжелой формой тяжести преобладает нарушение только этапа ранней активации, сопровождающегося продукцией и рецепцией цитокинов (95/25). Таким образом, предлагаемый способ диагностики состояния Т-системы иммунитета у больных ВГВ, ВГС и МГВС позволяет более эффективно оценить функциональное состояние ИКК и может использоваться для мониторинга и прогноза течения заболевания, а также для оценки эффективности проводимой терапии. Рассчитываемые соотношения обладают более высокой информативностью в сравнении с обычными параметрами иммунной системы. Способ прост в исполнении, не требует больших материальных и временных затрат по сравнению с известным способом. Источники информации 1. Клиническая иммунология и аллергология Учебное пособие / Под ред. А.В. Караулова. - М. Медицинское информационное агентство, 2002. - С. 365-369. 2. Тотолян А.А., Балдуева И.А., Бубнова Л.Н. и др. Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека // Мед. иммунол. - 1999. - Т. 1.5. - С. 23 3. Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Интерпретация лабораторных показателей при оценке иммунного статуса // Лабораторное дело. -2. - 1991. - С. 8. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8