Штамм Escherichia coli, продуцирующий плазмиду, обогащенную иммуностимулирующим CpG-мотивом

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(43) 2013.04.30 аспекты Сб. научн. трудов. Т. 1. (71) Заявитель Государственное научное Минск Изд. И.П. Логинов, 2007. - С. 130 учреждение Институт микробиоло 138. гии Национальной академии наук Бе 7935675 1, 2011. ларуси.. - 2010. . 43. - . 3. - . 164-169.(72) Авторы Коровашкина Анастасия Сер . е . . - 2002. - . 20. геевна Квач Сергей Вячеславович. 29. - . 29-30. - . 4668-4675. научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерийБИМ В-670 Д, продуцирующий плазмиду, обогащенную иммуностимулирующим -мотивом. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к генной инженерии, и решает задачу получения нового высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента плазмиды, обогащенной -мотивом.-мотивы представляют собой особые шестичленные нуклеотидные последовательности, содержащие в центральной своей части -динуклеотид-неметилированный,в отличие от подобных динуклеотидов, редко встречающихся в ДНК эукариот. При введении в организм человека и животных -мотивы стимулируют мощный неспецифический иммунитет против инфекционных патогенов, проявляют противоопухолевые и противоаллергенные свойства и, таким образом, могут найти применение в медицине качестве лекарственных субстанций 1-3. Для человека наиболее эффективной нуклеотидной последовательностью является, а для мышей и кроликов -1. В настоящее время используются в основном химически синтезированные 8-30 членные олигодезоксинуклеотиды (ОДН), содержащие -мотивы, у которых природная фосфодиэфирная межнуклеотидная связь заменена на фосфоротиоатную, поскольку такая связь более устойчива к действию нуклеаз 4, 5. Фосфоротиоатная модификация углеводного скелета -мотивов повышает их способность стимулировать В-лимфоциты, однако при этом, снижает эффективность стимуляции -клеток 6 и усиливает токсичность 7, 8. 17996 1 2014.02.28 Важно, что повторение несколько раз мотива в пределах ОДН повышает его иммуностимулирующую активность 9. Известны ДНК-вакцины, представляющие собой плазмиды, несущие гены, кодирующие те или иные чужеродные для организма-хозяина белки. В ряде случаев, для усиления иммуногенности в плазмиды встраивают несколько копий -мотива. Так, известна ДНК-вакцина против вируса иммунодефицита человека, несущая ген белка 160 этого вируса и 20 копий -мотива 10. Технология получения препарата плазмиды, обогащенной -мотивами, в работе не представлена. Известна ДНК-вакцина против вируса ящура, несущая ген капсидного белка этого вируса и 30 копий -мотива 11. Конкретный способ получения препарата плазмиды с -мотивом не описан. Известна ДНК-вакцина, кодирующая белок флагеллин бактерии, вызывающей мелиоидоз у больных диабетом. Адьювантом для этой вакцины служат встроенные в нее две копии -мотива 12. Известна плазмида 2-90, содержащая 90 различных -мотивов. В частности, она содержит 5 повторов тандема, составленного из 12 мотивов , 5 мотивови 1 мотива(в сумме - 90 различных -мотивов). Плазмида нарабатывалась в штамме-реципиенте-Тор 10 фирмыдля изучения ее влияния на иммунитет рыб и креветок 13. Информации о продуктивности полученного штамма в отношении плазмиды, обогащенной -мотивами, в работе не представлено. Известны ДНК-вакцины против вируса геморрагической септицемии-плазмиды-2 и -4, содержащие соответственно 2 и 4 копии фрагмента, содержащего 12 мотивов , 5 мотивови 1 мотив 14. Штаммреципиент, использовавшийся для наработки указанных плазмид и его технологические характеристики в работе не приведены. Из известных технических решений наиболее близким к предлагаемому является штамм 5, трансформированный плазмидой 2, несущей 8 копий -мотива 15 (прототип). Плазмида сконструирована из плазмидыи химически синтезированных -мотивов. Недостатком штамма-прототипа является небольшое число копий -мотива, содержащегося в целевой плазмиде (8), и невысокая продуктивность в отношении плазмидной ДНК (1 мг/л культуральной жидкости). Настоящее изобретение решает задачу получения штамма-11,который продуцирует плазмиду, содержащую повышенное число копий -мотива(96), и характеризуется повышенной продуктивностью в отношении плазмидной ДНК (5,5-6,0 мг/л культуральной жидкости). Для получения трансформирующего вектора плазмиду 12 (, Япония) обработали рестриктазой(, США) 12 ч при 37 С. Рестрикты разделили путем электрофореза в агарозном геле с последующим выделением из геля и очисткой фрагмента, размером 2440 п.н., с помощью набора(, Германия). Для получения двухцепочечной ДНК, содержащей -мотивы, использовали химически синтезированную прямую (-) и обратную (-) цепи олигодезоксинуклеотидов (ОДН) (жирным выделен участок, содержащий 4 повтора -мотива, италика сайт узнавания рестриктазы ).- 5- 5-. Для отжига ОДН реакционную смесь, содержащую - (500 пмоль), (500 пмоль), 20 мМ Трисбуфер ( 7,5), 10 мМ 2 и 50 мМ , прогрели при 95 С 5 мин, а затем медленно охладили в течение ночи до 4 С. Фосфорилирование 5-концов полученного дуплекса осуществили с помощью 4 полинуклеотидкиназы (, Россия). 2 17996 1 2014.02.28 Самолигирование фосфорилированного дуплекса провели по липким концам, соответствующим сайтам узнавания рестриктазы , с помощью Т 4-лигазы (, Литва). Продукт лигирования (двухцепочечный полиде-зоксинуклеотид -полинуклеотид) очистили с использованием набора реагентов(, Германия) согласно методике фирмы-изготовителя. Далее, реакционную смесь, содержащую 30 мкл раствора, полученного при самолигировании -полинуклеотидов (70 нг/мкл),ПЦР-буфер (67 мМ Трис- ( 8,3), 17 мМ (4)24, 2 мМ 2, 0,02 Твин-20),каждый из четырех природных дезоксинуклеозидтрифосфатов в концентрации 0,2 мМ, 1 ед активности -ДНК-полимеразы, инкубировали 20 мин при 72 С. Полученные -полинуклеотиды с дополнительными остатками дАМФ на 3 концах разделили с помощью электрофореза в 1 -ном агарозном геле. Вырезали участок геля, содержащий продукт наибольшего размера (900-1000 п.н). Продукты выделили из геля и лигировали с приготовленным ранее трансформирующим вектором. Для лигирования -полинуклеотида и вектора реакционную смесь, содержащую рестрицированную плазмиду 12 (30 фмоль), -полинуклеотид (90 фмоль),буфер для лигирования (, Литва), 4-ДНК-лигазу (2,5 ед) и воду (до 20 мкл), инкубировали 20 ч при 16 С. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки 5, полученные стандартным кальциевым методом 16, с последующим высевом на плотную питательную среду(1 триптон, 0,5 дрожжевой экстракт, 1),содержащую ампициллин в концентрации 150 мкг/мл. Каждую из пяти выросших одиночных колоний проанализировали на наличие целевой плазмиды методом ПЦР. Колонии, несущие целевую плазмиду, культивировали в средес ампициллином. Из полученных биомасс стандартным щелочным методом 16, выделили плазмиды. В результате была сконструирована плазмида -11, несущая вставку, содержащую 96 повторов иммуностимулирующего -мотива . Путем последующей трансформации плазмидой -11 клеток(3) (, США) был получен рекомбинантный штамм 11 - продуцент плазмиды, обогащенной -мотивом. Штамм-продуцент-11 отличается от штамма-реципиента(3) наличием рекомбинантной плазмиды 12, в которую встроены 96 копий иммуностимулирующего -мотива . В качестве генетического маркера эта плазмида содержит ген , придающей клеткам, трансформированным этой плазмидой, устойчивость к ампициллину. Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ В-670 Д и характеризуется следующими свойствами. Генотип., , , , , (3) (-)30610,17. Клетки содержат плазмиду -11 с геном , детерминирующим устойчивость клеток к ампициллину, и встроенным участком ДНК, содержащим 96 копий -мотива . Морфологические признаки. Клетки - грамотрицательные прямые палочки размером (1-1,5)(2-5) мкм подвижные, жгутикование перитрихальное. На мясо-пептонном агаре и агаризованной среде Адамса (30 С, 3 сут) колонии светло-желтые, гладкие, слабовыпуклые. Поверхность колоний блестящая с однородным рельефом. Края колоний слегка волнистые. Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства. Диапазон температуры роста штамма 9-40 С с оптимумом 37 С. -оптимум роста находится в диапазоне 7,0-7,5. 3 17996 1 2014.02.28 Факультативный анаэроб. Клетки-11 в качестве единственного источника углерода могут использовать ацетат, но не цитрат. Глюкозу и другие простые углеводы сбраживают с образованием пирувата, молочной, уксусной и муравьиной кислот. Индолположительны,не образуют 2 на железо-сахарной среде, не сбраживают лактозу и малонат, не гидролизуют желатин. Ауксотроф по -изолейцину. На бульоне Хоттингера к 24 ч (30 С) рост бактерий выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается при встряхивании (-форма). Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл) и тетрациклину (до 20 мкг/мл). Содержание ГЦ в составе ДНК 56,90,5 мол.(определено оптическим методом). Клетки-11 сохраняют жизнеспособность не менее полугода при хранении в холодильнике (4-8 С) на полноценной агаризованной среде (мясопептонный бульон, среда Хоттингера), содержащей ампициллин (150 мкг/мл), под слоем вазелинового масла, а также в лиофилизированном (криопротектор - 10 -ное обезжиренное молоко) состоянии. Клетки-11 обладают способностью продуцировать плазмиду-11 (содержащую 96 копий -мотива ), в количестве 5,5-6,0 мг/л культуральной жидкости. Для культивирования-11 применяют питательную среду 505 с микроэлементами 18 приготовленную на дистиллированной воде, следующего состава триптон - 1,0 дрожжевой экстракт - 0,5 глицерин - 0,5 глюкоза 0,0524 - 0,025 М 24 - 0,025 М 4 - 0,05 М 24 - 0,005 М 4 0,002 М 3 - 50 мкМ 2 - 20 мкМ 2 - 10 мкМ 4- 10 мкМ 2 - 2 мкМ 2 - 2 мкМ 2 - 2 мкМ, 24 - 2 мкМ 23 - 2 мкМ, 33 - 2 мкМ ампициллин - 150 мкг/мл ( 7,0). Посевным материалом служит суточная бактериальная культура, которую вносят в среду в количестве 1/100 от конечного объема среды. Культивирование проводят до оптической плотности 13-14 (600 нм). Затем клетки осаждают центрифугированием при 7000 в течение 10 мин и отмывают от питательной среды с помощью 0,15 М . Для определения продуктивности штамма в отношении плазмиды -11 из полученной биомассы выделяют плазмиду стандартным щелочным методом 16, растворяют в 0,15 М , содержащем 0,015 М цитрат натрия ( 7), и измеряют концентрацию по светопоглощению при 260 нм. При этом принимают, что коэффициент экстинкции двухспиральной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)-1 см-1 16. Продуктивность штамма-11 в отношении плазмиды, обогащенной -мотивом , составляющая 5,5-6,0 мг/л культуральной жидкости, значительно превышает продуктивность (1 мг/л культуральной жидкости) штаммапрототипа. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения плазмид, обогащенных -мотивом. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Пример 1. Культивирование-11 в оптимальных условиях. Культивирование-11 проводят в 4 колбах Эрленмейера объемом 2000 мл на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при температуре 37 С. Питательная среда (500 мл) для выращивания приготовляется на дистилированной воде и имеет следующий состав триптон - 1,04 17996 1 2014.02.28 дрожжевой экстракт - 0,5 глицерин - 0,5 глюкоза - 0,0524 - 0,025 М 24 - 0,025 М 4 - 0,05 М 24 - 0,005 М 4 - 0,002 М 3- 50 мкМ 2 - 20 мкМ 2 - 10 мкМ 4 - 10 мкМ 2 - 2 мкМ 2 - 2 мкМ 2 2 мкМ, 24 - 2 мкМ 23 - 2 мкМ, 33 - 2 мкМ ( 7,0). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 атм,15 мин. После стерилизации в среду вносят ампициллин до концентрации 150 мкг/мл. Посевным материалом служит суточная бактериальная культура, которую вносят в среду в количестве 1/100 от конечного объема среды. В процессе культивирования проводят измерение оптической плотности культуры при 600 нм до достижения культурой оптической плотности 13 о.е. По окончании выращивания клетки осаждают центрифугированием при 7000 в течение 10 мин, отмывают от питательной среды 0,15 М раствором(дважды по 50 мл). Получают 19,5 г сырой клеточной биомассы с содержанием плазмидной ДНК 0,6 мг/г клеток. Пример 2. Получение препарата плазмиды, обогащенной -мотивом. 19,5 г сырой биомассы клеток штамма-11, выращенных согласно примеру 1, ресуспендируют в 20 мл 25 мМ Трисбуфера ( 8,0), содержащего 50 мМ глюкозу и 10 мМ ЭДТА. К суспензии клеток добавляют 40 мл 0,2 М , содержащего 1 додецилсульфат натрия, аккуратно перемешивают и инкубируют на льду в течение 10 мин. Далее к суспензии добавляют 30 мл охлажденного 5 М ацетата калия ( 4,8), аккуратно перемешивают и инкубируют на льду в течение 10 мин. Полученный клеточный лизат центрифугируют при 1200020 мин при 4 С. К надосадочной жидкости добавляют цетавлон до конечной концентрации 0,1 и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугируют 10 мин при 12000. Полученный после центрифугирования осадок ресус-пендируют в 5 мл 3 М ацетата калия. Раствор осветляют центрифугированием (10 мин при 12000 ) и из супернатанта осаждают ДНК прибавлением 0,6 объема (3 мл) изопропанола. Осадок плазмидной ДНК собирают центрифугированием при 12000 в течение 30 мин при комнатной температуре,промывают 70 этанолом и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Для оценки количества и качества ДНК ее растворяют в 0,15 М , содержащем 0,015 М цитрат натрия ( 7), и измеряют светопоглощение при 230, 260 и 280 нм. Согласно примера 2, получают 11,76 мг плазмиды, характеризующейся коэффициентами 260/2801,8 и 260/2302,2, что соответствует высокой степени очистки целевого продукта. Наличие в плазмиде встроенных тандемных повторов -мотивов подтверждено методом рестрикционного анализа. С этой целью плазмидную ДНК инкубировали со смесью рестриктази , сайты узнавания которых ограничивают клонированный участок. Полученные в результате рестрикции фрагменты затем обработали рестриктазой , сайты рестрикции которой находятся внутри клонированного участка. Анализ продуктов рестрикции проводили путем электрофореза в 1 -ном агарозном геле (рис. 1 и 2). Число клонированных в плазмиде - -мотивов , составляющее 96, определили по формуле 1280 4,40 где 1 - размер фрагмента, полученного в результате обработки -11 смесью рестриктазии состоящего из клонированной вставки, окруженной фланкирующими участками (п.н.) 280 - суммарный размер фланкирующих участков (п.н.) 40 - размер 1 тандемного повтора -мотивов (п.н.) 4 - количество -мотивов в 1 тандемном повторе. 5 17996 1 2014.02.28 Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению с штаммом-прототипом следующими преимуществами продуцируемые плазмиды содержат 96 повторов -мотива вместо восьми значительно более высокая продуктивность в отношении плазмиды, обогащенной-мотивами (5,88 мг/л культуральной жидкости против 1 мг/л культуральной жидкости). Источники информации 1.//. . - 2002. - . 20. - . 709-760. 2. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Рыбалко С.Л., Шляховенко В.А. Иммуностимулирующая -ДНК перспективы клинического применения в онкологии // Онкология. - 2006. - Т. 8. -2. - С. 209-217. 3. Патент США 7935675, 2011. 4..,.,,.,.// . . - 1996. . 51. - . 173-182. 5. Патент США 6727230, 2004. 6.,., -// . . - 2003. . 8. - . 115-127. 7.Т.,.,,.,,.-// . . 1999. -. 162. - . 2368-2374. 8.,.,,,,,.,.,- - //. 2010. - . 43. - . 3. - . 164-169. 9..,,,.,.,.,,.,.,,,. . - 2000. - . 164. - . 1617-1624. 10..,,Т.,.,Т.,.,Т.,., .,.,.,.-1// . - 2002. - . 20. - . 23-24. - . 2857-2865. 11..,.,.,.,.,.,.,.,.//. - 2005. - . 24. - . 5. . 292-298. 12.,,,., -/// . . - 2006. - . 74. - . 3. - . 1699-1705. 13..,,//. - 2007. - . 23. - . 3. - . 589-600. 14. - ., - .,.,.,.-// . - 2011. - . 29. - . 6. - . 1289-1296. 15. Квач С.В., Казачкова Я.А., Зинченко А.И. Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей многокопийные -мотивы. Микробная биотехнология фундаментальные и прикладные аспекты Сб. науч. тр. Т. 1 / Под ред. Э.И. Коломиец и А.Г. Лобанка. - Минск Новапринт, 2007. - С. 130-138 (прототип). 6 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7