Препарат, обладающий антимикробным и антигерпетическим действием

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(72) Авторы Логинова Наталья Васильевна Полозов Генрих Иванович Юркштович Татьяна Лукинична Голуб Наталья Васильевна Чернявская Анна Анатольевна Ковальчук Татьяна Вячеславовна Костерова Раиса Ивановна(73) Патентообладатель Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(57) Препарат, обладающий антимикробным и антигерпетическим действием, включающий серебросодержащий компонент, поливинилпирролидон, мазевую основу и воду для инъекций, отличающийся тем, что в качестве серебросодержащего компонента содержит комплекс серебрас 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой, в качестве мазевой основы - эфир целлюлозы, выбранный из группы, включающей метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу, при следующем соотношении компонентов, мас.комплекс серебрас 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3 дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой 0,5-2,0 поливинилпирролидон 3,0-6,0 метилцеллюлоза 5,0-10,0 или гидроксипропилметилцеллюлоза,3,0-5,0 или карбоксиметилцеллюлоза 2,0-7,0 вода для инъекций остальное. Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к лекарственным средствам на основе комплексов серебра в виде гидрогелей, которые могут быть использованы для лечения ожогов различной природы (термических, химических, электри 15481 1 2012.02.28 ческим током, лучевых), мелких бытовых травм (порезов, ссадин), пролежней, трофических язв, инфицированных дерматитов, гнойных ран и других патологий, вызываемых размножением в ранах штаммов микроорганизмов, а также герпетических инфекций. Известно, что серебро в виде солей, комплексов и коллоидных частиц обладает выраженными антибактериальными свойствами. Для клинических целей выпускается ряд готовых серебросодержащих лекарственных форм 1, 2 мази (кремы) на основе сульфатиазола серебра (Аргосульфан) и сульфадиазина серебра (Сульфаргин, Силвадерм,Дермазин, Фламазин), коллоидные растворы серебра (Повиаргол, Колларгол, Протаргол,Арговит, Аргоника) и аэрозоли (Сильведерм и др.). В настоящее время для лечения инфицированных ран широко используются мази (или кремы) на основе вышеуказанных сульфамидных солей серебра, которые содержат 12 активного вещества и вспомогательные вещества, необходимые для получения мягкой лекарственной формы. Отличие вышеуказанных мазей от других серебросодержащих лекарственных форм 3, 4 состоит в том, что в их составе ионы серебра сочетаются с сульфаниламидными компонентами, что позволяет не только изменить фармакокинетические свойства препаратов, но и усилить их антимикробное действие 1, 2. Известно, что мази на основе сульфамидных солей серебра являются эффективными антибактериальными препаратами для наружного применения и используются для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных чувствительными к препарату микроорганизмами при ожогах, пролежнях, глубоких ранах и язвах. Так, мазь Силвадерм 1, 2, выбранная в качестве аналога заявляемого препарата, содержит 1 сульфадиазина серебра и вспомогательные вещества (вазелин белый, цетостериловый спирт, изопропилмиристат, этиленгликоль дистеарат, сорбитан моностеарат, алкильные эфиры полиоксиэтилена, пропиленгликоль, метилпарабен, вода бидистиллированная). Активный ингредиент препарата - сульфадиазин серебра - обладает бактерицидным типом действия, угнетая рост клеточной стенки бактерий. Испытанияпоказали, что спектр антибактериальной активности сульфадиазина серебра охватывает основные виды микробов, вызывающих инфицирование ожоговых и других ран на поверхности кожи,,.,.,. и др. Они проявляют чувствительность к сульфадиазину серебра в концентрации 50-100 мкг/мл. Однако применение мази Силвадерм ограничивается вследствие многочисленных побочных эффектов, свойственных сульфаниламидным препаратам (жжение, боль, лейкопения, агранулоцитоз, тромбоцитопения, аллергические реакции, нарушение пигментации и некроз кожи, многоформная эритема, диспептические явления, гепатит, гепатоцеллюлярный некроз, реакции со стороны ЦНС, токсический нефроз, интерстициальный нефрит и др.). Указано также, что не следует применять их для лечения глубоких гнойных ран и ожоговых поверхностей с обильной экссудацией. Кроме того, у пациентов ожоговых отделений с инфицированными ожогами нередко обнаруживаются бактерии, резистентные к сульфадиазину серебра 5, 6. Наряду с этим следует отметить, что присутствие гидрофобных компонентов в составе мази Силвадерм, а также в других мазях и кремах на основе сульфаниламидов серебра способствует нарушению в ране процессов газового и водного клеточного обмена, что снижает ранозаживляющее действие активного вещества. Наиболее близким к заявляемому препарату техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является серебросодержащее лекарственное средство для лечения инфицированных ран, выполненное в форме гидрогеля 4. Этот препарат содержит в качестве действующего вещества коллоидное серебро (0,07-0,48 ), стабилизатора - поливинилпирролидон (0,93-5,52 ), мазевой основы - гидрогель полиэтиленоксида ПЭГ 1500 (до 100 г). Полиэтиленоксид является сорбентом гнойно-некротических масс и других продуктов распада тканей, способствует очищению раны, обусловливает биодоступность активной субстанции и, как следствие, ускоряет заживление ран. К недостаткам этого препарата следует отнести следующие 1) узкий спектр антимикробной активности,2 15481 1 2012.02.28 поскольку экспериментально подтверждена, согласно 4, лишь антибактериальная активность 2) использование метода радиационной сшивки для получения мазевой основы геля ПЭГ-1500, что усложняет технологию данного препарата и делает ее менее доступной по сравнению с общепринятым технологическим регламентом для мазей. Задачей изобретения является получение нового эффективного препарата в виде стабильного гидрогеля для наружного применения, обладающего широким спектром терапевтического действия при отсутствии побочных эффектов и устойчивости к нему микроорганизмов. Поставленная задача достигается тем, что антимикробный и антигерпетический препарат, включающий серебросодержащий компонент, поливинилпирролидон (ПВП), мазевую основу и воду для инъекций, в качестве серебросодержащего компонента содержит комплекс серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой, в качестве мазевой основы - эфир целлюлозы, выбранный из группы, включающей метилцеллюлозу (МЦ), гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), при следующем соотношении компонентов, мас.комплекс серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3 дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой 0,5-2,0 поливинилпирролидон 3,0-6,0 метилцеллюлоза 5,0-10,0 или гидроксипропилметилцеллюлоза 3,0-5,0 или карбоксиметилцеллюлоза 2,0-7,0 вода для инъекций остальное. Получение комплексов серебра проводят согласно методике, описанной в 7. В качестве мазевой основы используют КМЦ (среднемассовая молекулярная масса в интервале от 100 до 700 кДа, марка 7, ) или электронейтральные эфиры целлюлозы МЦ(ТУ 2231-107-57684455-2003), ГПМЦ ( МР 333), которые являются техническими продуктами и известны как биосовместимые материалы с высокой адсорбционной способностью. Поливинилпирролидон в составе мази может иметь молекулярную массу от 25 до 350 кДа. Следует подчеркнуть, что используемый в качестве мазевой основы прототипа гидрогель полиэтиленоксида ПЭГ-1500 не пригоден для получения заявляемого препарата, поскольку при диспергировании в геле комплексаочень быстро происходит его разложение и образование черного осадка металлического серебра, неравномерно распределенного в объеме гидрогеля. Получение заявляемого препарата осуществляют в асептических условиях путем последовательного выполнения следующих операций набухания эфира целлюлозы в воде для инъекций (3/4 части от общего объема), растворения ПВП в другой 1/4 части воды для инъекций, соединения при постоянном перемешивании раствора ПВП и гидрогеля, а затем растирания мазевой основы с комплексомдо образования однородной гомогенной массы. Пример 1. 5,0 г МЦ заливают 63,7 г горячей воды для инъекций (80-90 С), охлаждают до 5 С и перемешивают до полного растворения полимера. 5,3 г ПВП растворяют в 25 г воды для инъекций. Полученные растворы сливают при перемешивании до получения однородной массы. 1 г комплексарастирают с частью мазевой основы в коллоидной мельнице до образования однородной массы и перемешивают с оставшейся частью основы. Мазь расфасовывают в темные флаконы, которые герметично закрывают резиновыми пробками и хранят при температуре 4 С. Пример 2. 2,0 г КМЦ при перемешивании растворяют в 65,7 мл воды для инъекций при комнатной температуре в течение 3-6 часов. Далее приготовление лекарственного препарата проводят аналогично примеру 1. Состав приведен в табл. 1. 15481 1 2012.02.28 Пример 3. 3,0 г ГПМЦ заливают 66,7 г горячей воды для инъекций (80-90 С) и перемешивают при охлаждении до полного растворения эфира целлюлозы. Далее приготовление лекарственного препарата проводят аналогично примеру 1. Состав приведен в табл. 1. Примеры 4-9. Лекарственные средства в виде мазей получают аналогично примеру 2. Состав и свойства мазей приведены в табл. 1. Антимикробная активность соответствующих препаратов представлена в табл. 2, а антигерпетическая активность - в табл. 3. Таблица 1 Состав и свойства заявляемого антимикробного и антигерпетического препарата Состав мази, мас.Примеры Комплекс Цвет МЦ ГПМЦ КМЦ ПВП 2 1 1,0 5,0 5,3 88,7 7,5 Серый 2 1,0 3,0 5,3 90,7 7,5 Бежевый с серым оттенком 3 1,0 2,0 5,3 91,7 6,7 Серый 4 1,0 5,0 5,3 88,7 7,6 Бежевый с серым оттенком 5 1,0 7,0 6,0 86,0 7,7 Серый 6 0,5 5,0 3,0 91,5 6,7 Серый 7 1,5 7,0 6,0 85,5 6,8 Серый 8 2,0 7,0 6,0 85,0 6,7 Серый 9 1,0 7,0 6,0 86,0 6,8 Серый Антибактериальную и антифунгальную активность образцов мазей 1-9, порошка комплекса(образец 10) и стандартных антибиотиков (стрептомицина, тербинафина) определяют в соответствии с рекомендациями по оценке чувствительности микроорганизмов к химическим соединениям методом серийных разведений в жидких средах 8 на тест-культурах грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесневых грибов (табл. 2). В качестве растворителя образцов используют диметилсульфоксид (для медицинского применения) в объеме 0,5-1,0 мл. После растворения образцов последующие двукратные разведения проводят в пробирках, в которых для достижения нужной концентрации объем раствора доводят жидкой полноценной или минимальной средой. Определение антибактериальной и антифунгальной активности образцов проводят в жидкой и на плотной агаризованной среде. Для этого исходные концентрированные растворы вносят в жидкую или плотную агаризованную среду. Посев бактерий осуществляют путем накапывания на подсушенную поверхность агаризованной среды в чашках Петри либо внесением суспензии бактерий в жидкую среду. Суспензию инкубируют при оптимальной для роста данных бактерий температуре в течение 24-48 час. Учет результатов проводят визуально по появлению мутности либо (в случае получения равномерной взвеси веществ при растворении) путем высева на агаризованную питательную среду. Чувствительность определяют по последней пробирке, в которой отсутствовал видимый рост микроорганизмов. За действующую дозу принимают минимальную ингибирующую концентрацию (МИК, мкг/мл). Для оценки уровня антифунгальной активности наблюдают зону задержки роста культуры. Посев грибов осуществляют уколом петлей из сформировавшегося мицелия. Используют концентрацию активного вещества 50 мкг/мл. Через определенные промежутки времени (24, 48, 96 часов) измеряют диаметр колоний грибов. По этому показателю сравнивают рост колоний в контроле и на среде с введенным в нее препаратом. Степень ингибирования радиального роста колоний грибов рассчитывают по формуле 100(-)/,где- диаметр колоний грибов в контроле- диаметр колоний грибов в опыте. Результаты испытаний оценивают в трех независимых экспериментах. 4 15481 1 2012.02.28 Испытание антивирусной активности образцов выполняют методом оценки цитопатического эффекта на монослойной культуре клеток рабдомиосаркомычеловека с вирусом герпеса простоготипа (ВГП-1). Критерием антивирусного действия считают среднеэффективную концентрацию соединения (50) - концентрацию, подавляющую цитопатогенное действие вируса на 50 . Максимальную переносимую концентрацию(МПК) изучаемого вещества определяют как его максимальную концентрацию с отсутствием морфологических изменений неинфицированных клеток после 48 часов инкубации. Отношение МПК/50 показывает диапазон нетоксических концентраций с антигерпетическим действием (табл. 3) все результаты приведены в сравнении с антигерпетическим препаратом - бутаминофеном. Результаты микробиологических тестов заявляемого препарата, представленные в табл. 2, позволяют оценивать его как новое эффективное химиотерапевтическое средство с антимикробной активностью, превышающей активность используемых в настоящее время лекарственных препаратов на основе антибиотиков (стрептомицина, тербинафина) и сульфаниламидных солей серебра, и более широкого спектра действия по сравнению с ними за счет сочетания высокой антибактериальной и антифунгальной активности. Таблица 2 Антимикробная активность заявляемого препарата МИК, мкг/мл Штаммы бактерий Стреп 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 томицин 3,125 1,06 1,06 1,06 3,125 1,06 1,06 1,06 1,06 3,125 МИК, мкг/мл Штаммы дрожжей Тербина 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 фин 3,125 3,125 1,06 1,06 3,125 6,25 1,06 1,06 1,06 3,125 Коэффициент ингибирования роста мицелия (, ) Штаммы грибов Тербина 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 фин 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 90 5 15481 1 2012.02.28 Продолжение таблицы 2 Коэффициент ингибирования роста мицелия (, ) Штаммы грибов Тербина 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 фин 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 60100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 80100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 60. 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50. 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 85 Образец 10 - порошок комплексабез вспомогательных веществН. - невосприимчивы. Таблица 3 Антигерпетическая активность заявляемого препарата Образец ВГП-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Бутаминофен 50(95), мкг/мл 7,39 7,66 7,72 7,15 7,66 7,39 7,92 8,22 8,36 7,86 10,87 МПК/ЕС 50 51,0 51,21 51,9 50,0 50,21 50,0 51,7 51,9 52,0 50,89 3,04 Как видно из данных табл. 3, заявляемый препарат высокоактивен в отношении вируса герпеса простого и нетоксичен для культуры клеток. Показатели его противовирусного действия свидетельствуют о более высокой активности в сравнении с известным противовирусным средством Бутаминофен, мазь 9. Заявляемый препарат, обладающий антимикробным и антигерпетическим действием,состоит из нетоксичных компонентов и, следовательно, является нетоксичным значение ЛД 50 для мышей составляет 1869,4 мг/кг, и, согласно классификации ГОСТ 12.1.007-76,соответствует веществам 5 класса (малотоксичные вещества, ЛД 501000 мг/кг). Заявляемый препарат соответствует всем требованиям, предъявляемым к лекарственному средству в виде мазей стабильность, цветность, однородность, , микробиологическая чистота и др. Он представляет собой однородный бежевый с серым оттенком или же светло-серый (в зависимости от состава) эластичный гидрогель, который легко растирается и удаляется с поверхности кожи. Заявляемый препарат является стабильным его активность сохраняется в течение срока наблюдения (более 1 года) при хранении в сухом защищенном от света месте при температуре от 4 до 10 С. Заявляемый препарат может быть получен в условиях предприятий, выпускающих фармацевтическую продукцию. Источники информации 1. Справочник Видаль Лекарственные препараты в России. - Издание одиннадцатое,переработанное, исправленное и дополненное, 2005. - 1520 с. 2. Машковский М.Д. Лекарственные средства в 2 т. / М.Д. Машковский. - 9-е изд. М. Новая волна, 2001. - Т. 2. - 576 с. 3. Серебро в медицине / Е.М. Благитко и др - Новосибирск Наука-Центр, 2004. 254 с. 4. Мазь для лечения инфицированных ран Пат. РФ 2146127, МПК 761 9/06, 61 33/38,61 17/02 / Е.В. Орловский П.П. Родионов С.А. Щербаков Н.С. Акентьев С.В. Мерзляков А.И. Порубов В.И. Ярохно Е.Ф. Панарин В.В. Копейкин Г.Е. Афиногенов 6. // . . . - 2003. - . 41. . 1192-1202. 7. Чернявская А.А. Синтез и антимикробная активность комплексов серебра и меди с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой / А.А. Чернявская и др. // Хим.-фарм. журн. - 2006. - Т. 40,8. - С. 7-9. 8. Першин Г Методы экспериментальной химиотерапии / Е.Н. Першин. - М. Медицина, 1971. - 536 с. 9. Противовирусное средство для лечения инфекций, вызванных вирусом простого герпеса Пат. Респ. Беларусь 6503, МПК 7261 31/05,61 31/22 / О.Т. Андреева,Л.Н. Дунец, П.Т. Петров, О.И. Шадыро, В.М. Царенков заявл. 25.10.2000 опубл. 25.08.04 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7