Тетрапептид, ингибирующий связывание аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека, и способ его получения

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ТЕТРАПЕПТИД, ИНГИБИРУЮЩИЙ СВЯЗЫВАНИЕ АУТОАНТИТЕЛ С ТИРЕОИДНОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Голубович Владимир Петрович Шутова Ирина Владимировна Грибовская Ольга Викторовна Мартинович Вера Павловна Цыганова Олеся Васильевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Тетрапептид формулы Вос, где Вос - третбутилоксикарбонил, ОМе - метил, ингибирующий связывание специфических аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека. 2. Способ получения тетрапептида по п. 1, заключающийся в том, что проводят реакцию конденсации метилового эфира -карбобензоксилизина с Вос с использованием дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента и гидроксибензатриазола в качестве противорацемической добавки, обрабатывают образовавшийся дипептид Вос(-)-, где- карбобензокси, 4,4 н растворомв этилацетате, проводят реакцию конденсации образовавшегося гидрохлорида дипептида с -, обрабатывают образовавшийся трипептид Вос(-)- 4,4 н растворомв этилацетате, проводят реакцию конденсации образовавшегося гидрохлорида трипептида с дициклогексиламмонийной солью -бензилового эфира третбутилоксикарбонил глутаминовой кислоты с образованием тетрапептида Вос-(-)(-)-, где- бензиловый эфир, и удаляют -группу и -группу каталитическим гидрогенолизом в присутствии палладиевой черни. Изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а именно к тетрапептиду , который ингибирует связывание аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека и может найти применение в медицине и экспериментальной биохимии в качестве лиганда иммуносорбента, а также для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы (АЗЩЖ) являются наиболее распространенными органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями. Установлено, что 12432 1 2009.10.30 АЗЩЖ развиваются в результате реакции иммунной системы на собственные белки щитовидной железы - тиреоидную пероксидазу, тиреоглобулин и рецептор тиреотропного гормона 1, которая проявляется появлением в высокой концентрации специфических аутоантител к указанным тиреоидным аутоантигенам в сыворотке крови больных. Антитела к тиреоидной пероксидазе присутствуют в сыворотке у большинства пациентов с болезнью Грейвса (более 80 ), тиреоидитом Хашимото (более 90 ), послеродовым тиреоидитом (66 ) и являются маркером аутоиммунных заболеваний щитовидной железы 2-5. Методом сайт-направленного мутагенеза определены некоторые фрагменты тиреоидной пероксидазы (ТПО 353-363, П 377-386, ТПО 506-514, ТПО 713-720, ТПО 766-775), принимающие участие в связывании со специфическими аутоантителами 6. Однако способность рекомбинантных пептидов, экспрессированных в культуре клеток яичников китайского хомячка, ингибировать связывание аутоантител с тиреоидной пероксидазой не превышает 45 при их концентрации 333,0 М. Это не позволяет использовать их в практических целях, например для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы либо в качестве лиганда иммуносорбента для избирательной элиминации патогенных аутоантител. Задачей настоящего изобретения является создание нового тетрапептида с общей формулой , где Вос - третбутилоксикарбонил, ОМе - метил, и молекулярным весом 588,3 г/моль. Заявляемый тетрапептид является структурным аналогом 734738739741, последовательности пространственно сближенных аминокислотных остатков, находящихся на поверхности глобулы белка тиреоидной пероксидазы, и отличается высокой способностью к связыванию с патогенными аутоантителами к тиреоидной пероксидазе человека по сравнению с известными пептидами. Структура заявляемого тетрапептида выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания тиреоидной пероксидазы человека со специфическими аутоантителами. Компьютерное конструирование участков связывания проводили с помощью разработанного авторами программного комплекса 7, позволяющего осуществить компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка. Чистота и структура созданного тетрапептида подтверждены методами массспектрометрии, аминокислотного анализа, ВЭЖХ. Масс-спектр конечного тетрапептида получен на масс-спектрометре РЕ 1 150 ( , США) с использованиемисточника ионов. Масс-спектр / 589,3, 611,3,489,3- 100. Аминокислотный анализ пептида, гидролизированного в запаянной ампуле 6 н НС в течение 20 часов при 100 С, выполнен на автоматическом аминокислотном анализаторе(Швеция). Данные аминокислотного анализа тетрапептида глутаминовая кислота 1,00 (1), глутамин 1,05 (1), -аланин 0,90 (1), лизин 1,05 (1). Аналитическая ВЭЖХ созданного соединения проведена на хроматографе фирмы(32, 966 фотодиодный детектор, колонка 20152 С 18 (2,1250 мм. Используемый градиент концентраций от 0 до 40 ацетонитрила в воде с добавлением 0,1. Скорость потока 1 мл/мин. По данным ВЖЭХ содержание целевого пептида - 94 . Способность заявляемого тетрапептида ингибировать связывание аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека подтверждается примером 1. Пример 1.ингибирование связывания аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека. Анализ ингибирующей способности пептидов проводят с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в полистирольных планшетах марки(- , Германия). Иммобилизацию полноразмерной тиреоидной пероксидазы человека (чТПО), выделенной из тканей щитовидной железы по методу 8, осуществляют методом пассивной адсорбции из 0,1 мл 0,1 М аНСО 3, рН 8,3, путем инкубации в тече 2 12432 1 2009.10.30 ние ночи при 4 С, используя чТПО в концентрации 0,3 мг/л. Блокирующую обработку пластика раствором БСАв 0,02 М -фосфатном буфере, рН 7,5, (1 г/л) проводят при 37 С в течение 2 ч. Калибровочные пробы, содержащие аутоантитела (ААТ) к тиреоидной пероксидазе человека в концентрациях 50, 250, 1000, 3200 МЕ/мл, готовят последовательным разведением пуловых патологических сывороток с высоким содержанием ААТ инкубационным буфером. Пробы сыворотки предварительно разводят в 100 раз инкубационным буфером 0,05 М трис-, содержащим 0,2 М , 0,02 твин 20 и 1 г/л БСА, рН 7,5. Для выявления ингибирующего влияния пептидов на связывание ААТ с чТПО инкубируют анализируемое соединение в пошаговых концентрациях 0,01, 0,1, 0,5, 1 мМ в течение 2 ч при комнатной температуре с сывороткой крови человека, содержащей ААТ к чТПО в концентрации 1000 МЕ/мл. Затем в лунки микроплашета с иммобилизованной чТПО вносят по 0,1 мл исследуемого раствора ААТ с пептидом или калибровочных проб с известным содержанием ААТ к чТПО и инкубируют в течение 0,5 ч при комнатной температуре с периодическим встряхиванием. На второй стадии анализа в каждую лунку вносят 0,1 мл конъюгата пероксидазы из корней хрена (, Великобритания) с антителами козы против иммуноглобулинов человека в предварительно подобранном разведении и инкубируют в течение 30 мин при 37 С. Для удаления неадсорбированных белков после каждой стадии анализа лунки промывают трижды по 0,2 мл 0,05 М трис, содержащим 0,2 Ми 0,2 Твин 20, рН 7,5. Ферментативную реакцию перекисного окисления инициируют внесением в лунки по 0,1 мл смеси (14) 0,01 М 3,35,5-тетраметилбензидина в 70 диметилсульфоксиде и 5 мМ 22 в 0,15 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0. Реакцию продолжают в течение 15 мин и останавливают добавлением 0,1 мл 4,824, затем измеряют поглощение раствора при 450 нм (А 450) в анализаторе иммуноферментном фотоэлектрическом АИФ М/340(Витязь Беларусь). Снижение величины показателя оптической плотности в лунках с исследуемым пептидом отражает уменьшение концентрации связавшихся ААТ с ТПО. Заявляемый тетрапептид в концентрации 1 мМ снижает показатель оптической плотности на 22 , что соответствует снижению концентрации ААТ с 1000 МЕ/мл до 200-220 МЕ/мл (таблица). Ингибирование связывания ААТ с чТПО тетрапептидом . в концентрации 0,1 мМ Связывание ААТ с ТПО в присутствии -1,415 200-220 в концентрации 1 мМ Из представленных в таблице данных можно сделать вывод, что тетрапептид в концентрации 1 мМ проявляет наибольшую активность по отношению к ингибированию связывания специфических аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека по сравнению с известными рекомбинантными пептидными соединениями, и может найти применение в медицине в качестве лиганда иммуносорбента для избирательной элиминации патогенных аутоантител, а также в медицине и биохимии в качестве реагента в иммуноферментных тест-системах для выявления специфических аутоантител при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Другой задачей изобретения является способ получения заявляемого тетрапептида Вос. 3 12432 1 2009.10.30 Известен способ получения содержащих пептидов 8, включающий в себя жидкофазный способ с применением ,-бис(трифторацетил)-лизина в качестве производного аминокислоты лизин. Однако при использовании трифторацетил производных аминокислот может наблюдаться значительная рацемизация, и соответственно этот метод не применим для получения заявляемого тетрапептида. Заявляемый способ получения тетрапептида включает в себя последовательное присоединение третбутилоксикарбонил(Вос-)-аминокислот к Сконцевым фрагментам. На первой стадии лизин вводят в реакцию в виде метилового эфира -карбобензокси-лизина, который конденсирован с ВосА 1 а-ОН. В качестве основного конденсирующего агента на первой, третьей и пятой стадиях используют дициклогексилкарбодиимидс добавлением гидроксибензатриазолав качестве противорацемической добавки. Снятие Вос-защиты с дипептида Вос проводят обработкой 4,4 н раствором НС в этилацетате в течение 40 мин (стадия 2) конденсация соединения (-)- с приводит к получению трипептида (-)- (стадия 3). Последующее снятие Восзащиты с этого трипептида (стадия 4) и конденсация образовавшегося гидрохлорида с дициклогексиламмонийнойсолью -бензилового эфира третбутилоксикарбонилглутаминовой кислоты приводят к защищенному тетрапептиду -(-)(-)- (стадия 5). Удаление защитных групп с -аминогруппы лизина и -карбоксила глутаминовой кислоты групп осуществляют в одну стадию - каталитическим гидрогенолизом в присутствии катализатора палладиевая чернь (стадия 6). Синтез заявляемого тетрапептида осуществляют по следующей схеме Заявляемый способ получения тетрапептида позволяет вводить лизин в виде метилового эфира -карбобензокси-лизина, а глутаминовую кислоту в виде дициклогексиламмонийной соли -бензилового эфира третбутилоксикарбонилглутаминовой кислоты и получать целевой пептид с минимальным числом стадий и высокими постадийными выходами (суммарный выход тетрапептида - 33,7 ). Сущность заявляемого способа подтверждается примером 2. Пример 2. Получение тетрапептида . В примере приведены хроматографические подвижности в системах (А) - хлороформметанол-20 -ный аммиак, 604010, (Б) - бутанол-уксусная кислота-вода, 401010,(С) - хлороформ-уксусная кислота-вода, 302010. Удельное вращение определяли на спектрополяриметре -20 (, Япония). Стадия 1. Получение (-)- . К раствору 1,20 г (4,2 ммоль) хлоргидрата метилового эфира -карбобензокси-лизина в 4,0 мл ДМФ прибавляют 0,6 мл триэтиламина (4,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 15 минут и затем вносят 0,75 г (4,0 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-аланина. После охлаждения до 0 С в реакционный сосуд прибавляют последовательно 0,56 г (4,2 ммоль) гидроксибензатриазолаи 0,90 г (4,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида . Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0 С и 5 ч при комнатной температуре. После окончания реакции осадки дициклогексилмочевины 5(ДЦГМ) и ТЕАНС отфильтровают, промывают на фильтре 2,0 мл ДМФ. В фильтрат добавляют 15 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором 3, насыщенным раствором натрия хлорида,водой, сушат над 24. После сушки этилацетат упаривают, а образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира петролейным эфиром и сушат над 25. Получают 1,52 г (выход 88 ) соединения ,0,62 (Б). Стадия 2. Получение (-)- . К раствору 1,50 г (3,4 ммоль) (-)- в 0,8 мл этилацетата добавляют 13,9 мл 4,4 н раствора НС в этилацетате. Перемешивают образовавшуюся взвесь в течение 40 мин, затем осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре этилацетатом, эфиром, сушат в эксикаторе над . Получают 1,23 г (выход 99 ) соединения 20 - 10,0 (С 1, МеОН)0,58 (А). Стадия 3. Получение (-)- . К раствору 1,19 г (3,2 ммоль) (-)-в 4,0 мл ДМФ добавляют 0,53 мл (3,8 ммоль) триэтиламина (рН 8-9). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 мин и затем вносят 0,79 г (3,2 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-глутамина. Охладив реакционную колбу до 0 С, вносят последовательно 0,45 г (3,3 ммоль)и 0,78 г(3,8 ммоль) . Время прохождения реакции - 4 часа. После окончания реакции осадок ДЦГМ и ТЭАНС отфильтровывают, промывают небольшим количеством ДМФ, а к фильтрату добавляют 20,0 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором 3, насыщенным раствором натрия хлорида, водой, сушат над 24. После сушки этилацетат упаривают, а образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира петролейным эфиром и сушат над 25. Получают 0,65 г (выход 68 ) соединения , 20 - 14,5 (С 1, МеОН)0,88 (А). Стадия 4. Получение (-)- . К суспензии 0,51 г (0,9 ммоль) (-)-в 1,0 мл этилацетата добавляют 4,6 мл 4,4 н раствора НС в этилацетате. Реакционную смесь перемешивают около часа, затем растворитель упаривают, а остаток промывают этилацетатом, эфиром. Сушат в эксикаторе над . Получают 0,43 г (выход 98 ) соединения 2011,1 (С 1, МеОН)0,36 (С). Стадия 5. Получение -(-)(-)- . К раствору 0,40 г (0,8 ммоль) соединенияв 2,5 мл ДМФ добавляют 0,41 г(0,8 ммоль) дициклогексиламмонийной соли-трет.бутилоксикарбонилбензилового эфира глутаминовой кислоты (рН 8-9). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 минут, выпадает осадок НС. Охладив реакционную колбу до 0 С, вносят последовательно 0,12 г (0,9 ммоль)и 0,21 г (1,0 ммоль) . Время прохождения реакции - 6 часов. После окончания реакции осадок ДЦГМ и НС отфильтровывают, промывают небольшим количеством ДМФ, а к фильтрату добавляют 20,0 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором аНСО 3, насыщенным раствором натрия хлорида, водой, сушат над 24. Этилацетат упаривают, образовавшийся остаток переосаждают из метанола эфиром. После сушки в эксикаторе над 2 О 5 получают 0,42 г (выход 68 ) соединения 20 13,6 (С 1, МеОН)0,79 (А). Стадия 6. Получение тетрапептида . Через раствор 0,35 г (0,40 ммоль) соединения -(-)(-)в смеси 0,5 мл уксусной кислоты и 4,0 мл метанола пропускают в течение 2 ч ток водорода в присутствии катализатора - 0,0025 г палладиевой черни - при постоянном перемешивании. После деблокирования пептида (контроль ТСХ) катализатор отделяют фильтрованием, фильтрат упаривают, осадок переосаждают из метанола эфиром, сушат в,/ . -./2003/003678. - Заявл. 11.02.2003. - Опубл. 01.07.2004. 7. Шутова, И.В. Компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул / И.В. Шутова, Л.М. Чемитова, В.П. Голубович // Химия, структура и функция биомолекул Тез.докл.- Минск, 2006. - С. -162. 8. Цыганова, О.В. Характеристика иммуноаффинной хроматографии и новый метод получения тиропероксидазы человека из субклеточных фракций щитовидной железы / О.В. Цыганова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42,2. С. 236-346. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7