Способ оценки сорбционной способности эритроцитов

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ СОРБЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт фотобиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гаврилов Виктор Борисович Кравченко Ольга Николаевна Конев Сергей Васильевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт фотобиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ оценки сорбционной способности эритроцитов, включающий инкубацию эритроцитарной массы с раствором катионного красителя с последующим ее отделением,измерение оптической плотности раствора красителя до и после инкубации и расчет показателя сорбционной способности эритроцитов, отличающийся тем, что в качестве раствора катионного красителя используют 100 мкМ раствор нильского голубого,эритроцитарную массу и раствор красителя берут в объемном соотношении 17, а показатель сорбционной способности эритроцитов рассчитывают по формуле 7(0)/,где 0 и- оптическая плотность раствора красителя до и после инкубации с эритроцитарной массой.(56) Тогайбаев А.А. и др. // Лабораторное дело. - 1988,9. - С. 22-24.1503015 1, 1989.1096210 , 1984. Селиванова Г.В. и др. Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия. - Ленинград, 1977. - Вып. 17. - С. 83-86.1429020 1, 1988. Изобретение относится к гематологии, а именно к анализу состояния эритроцитов, и может быть использовано в медицинской диагностике для выявления предгемолитических повреждений эритроцитов, а также в фармакологии для оценки токсического или протекторного действия различных физиологически активных веществ на эти клетки. Известно, что повышение сорбции красителей является одним из ранних индикаторов повреждения животных клеток при самых различных патологических воздействиях. Однако измерение сорбции красителей, выполненное на нервных и мышечных тканях, не может быть использовано для эритроцитов. Наиболее близким к предлагаемому изобретению и принятым за прототип является способ оценки сорбционной способности эритроцитов (ССЭ), основанный на окраске клеток метиленовым синим (МС) 1. По этому методу к 1 мл эритроцитарной массы, полученной после отделения плазмы крови путем центрифугирования, добавляют 3 мл раствора МС с концентрацией 670 мкМ или 0,025 . Смесь инкубируют 10-15 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют и измеряют оптическое поглощение супернатанта при 630 нм. Показатель сорбционной способности эритроцитов рассчитывают по убыли концентрации красителя в растворе по формуле /100(1-/), гдеи- оптическая плотность раствора красителя до и после инкубации с эритроцитами. Установлено, что при гнойно-септических заболеваниях показатель / возрастает до 190 по отношению к норме. Однако этот метод обладает рядом недостатков. Во-первых, МС нестабилен в растворе и обесцвечивается в результате окислительно-восстановительных реакций. Поэтому при анализе используется раствор красителя с небольшим сроком хранения (не более 2-3 дней). Во-вторых, по результатам наших исследований, этот метод обладает недостаточно высокой чувствительностью, которая обусловлена сорбционными свойствами МС и использованием в качестве критерия ССЭ показателя /. Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в увеличении стабильности красителя при хранении в растворе и повышении чувствительности способа к повреждению клеток. Поставленная задача решается способом определения сорбционной способности эритроцитов путем добавления к одной объемной части эритроцитарной массы 7 объемных частей 100 мкМ раствора нильского голубого, измерения оптической плотности супернатанта после инкубации смеси и отделения эритроцитов и вычисления отношения концентраций сорбированного и свободного красителя по формуле 7(-)/, гдеиоптическая плотность раствора красителя до и после инкубации с эритроцитами. Разработанный способ осуществляют следующим образом. Утром натощак отбирают венозную или капиллярную кровь в пробирку, содержащую консервант-антикоагулянт(0,1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5,1), в объемном отношении кровь консервант 91. Пробу центрифугируют при 3 тыс.об/мин 10 мин и супернатант удаляют. К 200 мкл эритроцитарной массы добавляют 1,4 мл 100 мкМ раствора нильского голубого, приготовленного на физиологическом растворе с рН 7,4. Смесь перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 20 мин, затем центрифугируют 5-10 мин при 3 тыс об/мин и измеряют оптическую плотность в супернатанте при 630 нм. Оценку ССЭ производят по 2 5794 1 показателюпо формуле 7( - )/, гдеи- оптическая плотность раствора красителя до и после инкубации с эритроцитами. Отличительная сущность предлагаемого изобретения заключается в использовании нового, ранее не применявшегося для этих целей, катионного красителя - нильского голубого, оптимизации условий инкубации красителя с клетками путем сопоставления интактных и поврежденных эритроцитов с использованием нового расчетного показателядля оценки ССЭ. Существенность предлагаемых приемов для оценки ССЭ новым способом подтверждается следующими исследованиями и примерами. 1. Оптимизация концентрации красителя в инкубационной среде. Для оптимизации условий инкубации красителя с эритроцитами было проведено сравнение показателей ССЭ для нативных и поврежденных эритроцитов с целью выявления максимальной чувствительности сорбции к повреждению клеток. В качестве поврежденных эритроцитов использовали клетки, обработанные детергентом цетилтриметиламмонийбромидом (ЦТАБ) в концентрации 20-60 мкМ, который подобно многим бактериальным и животным токсинам увеличивает проницаемость клеточных мембран. Оценку ССЭ проводили с помощью показателя/Э( - )/, гдеи Э - объемы раствора красителя и эритроцитарной массы. С увеличением в среде концентрации нильского голубого (НГ) показательдля нативных и поврежденных клеток резко снижался, что объясняется насыщением сорбционных центров в эритроцитах (рис. 1). При этом во всем концентрационном диапазоне НГ сорбция красителя поврежденными клетками превышала его сорбцию нативными эритроцитами. Кривая отношения показателейдля поврежденныхи нативныхэритроцитов / имела резко выраженный максимум в области концентраций 100 мкМ,которая и была выбрана для нового метода анализа. 2. Оптимизация объемного соотношения раствора красителя и эритроцитарной массы. С увеличением объема раствора НГ (С) при его постоянной концентрации и постоянном объеме эритроцитарной массы (Э) показательдля нативных и поврежденных клеток медленно повышался (рис. 2). Это повышение обусловлено увеличением емкости раствора красителя и установлением сорбционного равновесия при более высокой остаточной концентрации НГ в среде. Отношение показателей / также имело хорошо выраженный максимум в области /Э 5-9. Поэтому для нового метода было выбрано значение /Э 7. Пример 1 Отбирают 1 мл венозной крови здорового донора в пробирку, содержащую 0,11 мл 0,1 М цитратно-фосфатного буфера с рН 5,1. Пробу центрифугируют при 3 тыс. об/мин 10 мин и супернатант удаляют. К 200 мкл эритроцитарной массы добавляют 1,4 мл 100 мкМ нильского голубого, приготовленного на физиологическом растворе с рН 7,4. Смесь перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 20 мин, затем центрифугируют 5-10 мин при 3 тыс.об/мин и измеряют оптическую плотность в супернатанте при 630 нм. Чтобы исключить концентрационное снижение оптической плотности красителя, отобранную пробу супернатанта разводят в 2 раза дистиллированной водой и измеряют поглощение в кювете толщиной 0,5 см на КФК-2 МП так, чтобы измеряемое значение И 30,75. Получено значение И 30,527, что соответствует величине 2 ИЗМ 1,054. Оценку ССЭ производят по формуле 7(-)/, где- оптическая плотность раствора красителя до инкубации с эритроцитами. Оптическая плотность исходного раствора НГ, разведенного водой в 2 раза, составила ОИЗМ 0,731 и 2 И 31,462. Определяемое значение 7(1,462-1,054)71,0542,73. Пример 2 Отбирают 500 мкл капиллярной крови у больного с перитонитом в пробирку, содержащую 45 мкл указанного консерванта. После центрифугирования и удаления супернатанта к 200 мкл эритроцитарной массы добавляют 1,4 мл 100 мкМ раствора нильского 3 5794 1 голубого. Последующий анализ проводят аналогичным образом. Для разведенного в 2 раза водой супернатанта И 30,157 и, соответственно,2 И 30,314. Показатель 7(1,462-0,314)70,31425,6. Сопоставление предлагаемого способа со способом-прототипом показало следующие преимущества 1. Увеличение срока хранения раствора красителя более чем в 10 раз. Оптическая плотность раствора МС при его хранении в холодильнике уже через 3 дня снижалась на 10 , а после 30 дней хранения падала до 44 по отношению к исходному уровню(рис. 3). Раствор НГ в этих же условиях хранения показал высокую стабильность и за 30 дней хранения его оптическая плотность практически не изменилась. 2. Увеличение чувствительности к повреждению клеток при действии токсических агентов на 50-70 . Было проведено сопоставление ССЭ, измеренной известным и предлагаемым способом, у нативных и поврежденных эритроцитов после их обработки 40 и 60 мкМ ЦТАБ(таблица 1). Таблица 1 Сопоставление известного и предлагаемого методов оценки сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) для интактных и поврежденных клеток после их обработки цетилтриметиламмонийбромидом (ЦТАБ)(/ - отношение показателей ССЭ поврежденных и интактных клеток) Повреждающее воздействие После обработки 40 мкМ ЦТАБ показатель увеличивался на 25 по отношению к нативным клеткам. Для той же степени повреждения эритроцитов показатель , измеренный новым методом, увеличивался на 78 по отношению к нативным клеткам. Таким образом, новый метод при этом уровне повреждения клеток давал на 53 большую чувствительность, чем известный метод. Аналогичное сравнение показателя /, измеренного известным способом, и показателя , измеренного новым методом, при более сильном повреждении клеток (обработка 60 мкМ ЦТАБ) выявило увеличение чувствительности к повреждению нового метода на 70 по сравнению с известным способом. 3. Увеличение чувствительности диагностики эндотоксикоза при гнойно-септических заболеваниях в 3,4 раза. Так как известный способ используется для диагностики эндогенной интоксикации при гнойно-септических заболеваниях, было проведено сопоставление показателей ССЭ,измеренных известным и предлагаемым методом, у доноров и больных с данной патологией (перитониты, гнойные аппендициты и холециститы) (таблица 2). Показатель ССЭ,измеренный известным методом, у больных с гнойно-септическими заболеваниями возрастал до 176 по отношению к норме, что согласуются с опубликованными данными. Тогда как новый показатель ССЭ, измеренный у этих же больных, возрастал в 6 раз. Таким образом, новый метод обладает в 3,4 раза большей чувствительностью по сравнению с известным методом при диагностике токсин-индуцированных повреждений эритроцитов при гнойно-септических заболеваниях. 4 5794 1 Таблица 2 Сопоставление известного и предлагаемого методов оценки сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) для здоровых доноров и больных с гнойно-септическими заболеваниями Больные с гнойно-септическими Показатель ССЭ заболеваниями вк норме Полученные результаты показывают области применения предлагаемого способа, в частности в медицинской диагностике для оценки увеличения сорбционной способности эритроцитов при патологических состояниях, например у больных с гнойно-септическими заболеваниями, а также в токсикологии для оценки цитотоксического действия повреждающих агентов и в фармакологии при скрининге новых лекарственных препаратов с цитопротекторным действием. Источники информации 1. Тогайбаев А.А., Кургузкин А.В., Рикун И.В., Карибжанова Способ диагностики эндогенной интоксикации // Лабораторное дело. - 1988. -9. - С. 22-24 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6