Средство для снижения проявлений окислительного стресса, вызванного введением липополисахарида E.coli, у млекопитающего

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ПРОЯВЛЕНИЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА, ВЫЗВАННОГО ВВЕДЕНИЕМ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(72) Авторы Шульга Екатерина Владимировна Зинчук Виктор Владимирович(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(57) Применение рекомбинатного человеческого эритропоэтина- в качестве средства для снижения проявлений окислительного стресса, вызванного введением липополисахарида., у млекопитающего. Изобретение относится к области медицины, в частности к лекарственным средствам,может быть использовано для коррекции окислительных повреждений. В нормальных аэробных условиях жизнедеятельности организма активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантная система уравновешивают друг друга. Дисбаланс прооксидантно-антиоксидантного равновесия, выражающийся в усилении продукции активных форм кислорода и ослаблении эффективности антиоксидантной защиты,является основной причиной развития окислительного стресса 7. Как известно, гемоглобин, изменяя свое сродство к кислороду, может регулировать поток кислорода в ткани в соответствии с их потребностью в нем и тем самым предупреждать избыточное его использование для свободнорадикального окисления, что позволяет рассматривать сродство гемоглобина к кислороду как один из факторов поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма 3. Избыточное образование первичных (диеновые коньюгаты (ДК, промежуточных (малоновый диальдегид (МДА) и др.) и конечных (основания Шиффа и др.) продуктов ПОЛ оказывает повреждающее действие на уровне мембран и способствует деструкции клеток 4. Для коррекции данного состояния в медицине используются различные лекарственные средства. Известно применение -липоевой кислоты для уменьшения интенсивности свободнорадикальных процессов и повышения факторов антиоксидантной системы 13. 15877 1 2012.06.30 Недостатком данного препарата является отсутствие воздействия на параметры кислородтранспортной функции крови. Известно, что -токоферол (тролокс) обладает выраженными антиоксидантными свойствами и мембранопротекторной активностью 8. Недостаток данного средства - отсутствие влияния на механизмы транспорта кислорода кровью. Установлено, что использование верапамила и нифедипина влияет на показатели кислородтранспортной функции крови 10. Недостатком является усиление процессов ПОЛ и отсутствие воздействия на антиоксидантную систему. Однонаправленность действия данных препаратов (либо на интенсивность свободнорадикальных процессов, антиоксидантную систему, либо на показатели кислородтранспортной функции крови) ограничивает их применение для снижения окислительных повреждений. Задача изобретения - расширение арсенала средств для ослабления и уменьшения проявлений окислительного стресса, коррекции окислительных повреждений. Данная задача решается путем применения рекомбинатного человеческого эритропоэтина- в качестве средства для улучшения показателей кислородтранспортной функции крови и прооксидантно-антиоксидантного состояния при окислительном стрессе. Молекула эритропоэтина (ЭПО) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 30400 Да, содержащий в своем составе 40 углеводов и 14 остатков сиаловых кислот 12, обладающий выраженными гемопоэтическими эффектами. В современной медицине широко используется ЭПО, который активирует митоз и созревание эритроцитов из клеток-предшественников эритроцитарного ряда, эффективно регулирующий эритропоэз. Однако в последние годы обсуждается вопрос о его неэритропоэтических функциях 2. ЭПО ингибирует активность транскрипционного нуклеарного фактора каппа В, снижает фактор некроза опухоли-, интерлейкин-6 при ишемии-реперфузии, а также уменьшает проницаемость микрососудов и улучшает процессы оксигенации в легких 14. Есть данные, что ЭПО уменьшает прямые цитостатические эффекты липополисахарида (ЛПС),повышая супероксиддисмутазу в тканях почки 11. Однако с очевидностью нельзя утверждать, что данный препарат можно использовать для ослабления проявлений окислительного стресса и уменьшения окислительных повреждений. Эксперименты проводились на кроликах-самцах (17) массой 2,5-3,5 кг, которые содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище,20-22 С и искусственном освещении (1212). Для моделирования окислительного стресса животным внутривенно вводился ЛПС Е. ( 1114,-2630) в дозе 500 мкг/кг. С целью уменьшения окислительных повреждений, за 30 минут до введения ЛПС, осуществлялась однократная инъекция рекомбинатного человеческого эритропоэтина- - Эпофит (фирмы) внутрибрюшинно в дозе 1000 Ед/кг. В условиях адекватной аналгезии через 12 часов после инъекции ЛПС проводили забор крови из правого предсердия для оценки кислородтранспортной функции крови и измерения уровня нитрат/нитритов в плазме, а затем образцов тканей (легкие, сердце, печень, почки и аорта) для определения показателей прооксидантно-антиоксидантныго баланса. Оценку параметров кислородтранспортной функции и кислотно-основного состояния в исследуемых образцах крови проводили при температуре 37 С на микрогазоанализаторе, а такжекрови, напряжение углекислого газа (2), концентрация бикарбо ната (3 ) и общей углекислоты плазмы (2), реальный и стандартный недоста 2 15877 1 2012.06.30 ток/избыток буферных оснований (/), стандартный бикарбонат . По показателю 50 (2 крови при 50 насыщении ее кислородом) определяли сродство гемоглобина к кислороду методом смешивания при температуре 37 С,7,4, 240 мм рт. ст. (50 станд) 16, а затем рассчитывали 50 при реальных условиях этих параметров по формулам (50 реал) 17. Продукциюоценивали по суммарному содержанию нитрат/нитритов в плазме крови спектрофотометрическим методом,основанным на цветной реакции с использованием реактива Грисса при длине волны 540 нм 9. По содержанию первичных и вторичных продуктов ПОЛ оценивали активность свободнорадикальных процессов. Уровень ДК определяли по интенсивности УФ-поглощения на спектрофотометре СФ-46 в области 232-234 нм 1. Содержание МДА измеряли спектрофотометрически по насыщенности окраски триметинового комплекса розового цвета на 1251 при длине волны 535 нм 15. Уровень факторов антиоксидантной защиты определяли по концентрации -токоферола в гексановой фракции на спектрофлуориметре -4010 при длине волны возбуждения 295 нм и эмиссии 326 нм 6, а также по активности каталазы на спектрофотометре 1251 при длине волны 410 нм 5. При введении ЛПС наблюдается ухудшение кислородтранспортной функции крови, в то время как использование ЭПО перед ЛПС увеличивает значения 2 на 30,6(0,05), 2 на 21,6(0,05) и 2 на 22,4(0,05), однако показательдостоверно не изменяется. Однократная инъекция ЭПО уменьшает развитие метаболического ацидоза, повышаяна 0,083 ед. (0,05), а также увеличивая значения 3 на 19,8(0,05), 2 на 18,8(0,05),на 32,2(0,05),на 29,2(0,05),на 18,7(0,05) по отношению к группе животных, получавших только ЛПС. При введении ЭПО параметр 50 реал снижается на 7,2(0,05), что вызывает повышение сродства гемоглобина к кислороду и, соответственно, отклонение кривой диссоциации оксигемоглобина при реальных условиях циркуляции влево, в то время как показатель р 50 при стандартных значениях , 2 и температуры повышается на 5,6(0,05) в сравнении с группой животных, получавших только ЛПС. Использование ЭПО приводит к уменьшению содержания нитрат/нитритов на 8,38 мкмоль/л (0,05) по отношению к группе животных, получавших только ЛПС. Применение ЭПО перед ЛПС снижает уровень ДК на 16,6(0,05) в аорте, на 15,1(0,05) в сердце, на 20,4(0,05) в легких, на 32,4(0,05) в печени и на 19,5(0,05) в почках, а также уровень МДА в аорте на 37,7(0,05), в сердце на 17,7(0,05), в легких на 36,5(р 0,05), в печени на 17,3(0,05) и в почках на 25,3(0,05) по отношению к группе животных, получавших только ЛПС. Одновременно с уменьшением интенсивности свободнорадикальных процессов наблюдается повышение уровня антиоксидантных факторов защиты при введении ЭПО и ЛПС. Так, концентрация -токоферола увеличивается в аорте с 8,00,22 до 9,20,11 мкмоль/г(0,05), в сердце с 4,80,25 до 7,50,20 мкмоль/г (0,05), в легких с 7,10,24 до 7,90,20 мкмоль/г (0,05), в печени с 5,10,36 до 8,20,26 мкмоль/г (0,05) и в почках с 6,70,25 до 7,70,28 мкмоль/г (0,05) по отношению к группе животных, получавших только ЛПС. Наиболее значимо активность каталазы при введении ЭПО и ЛПС повышается в аорте с 1,60,15 до 2,70,11 ммоль 22/мин/г белка (0,05), в сердце с 2,30,33 до 3,10,13 ммоль 22/мин/г белка (0,05), в легких с 1,20,23 до 2,70,15 ммоль 22/мин/г белка (0,05), в печени с 1,90,25 до 2,70,13 ммоль 22/мин/г белка (0,05) и в почках с 3,00,19 до 3,80,18 ммоль 22/мин/г белка (0,05) в сравнении с группой животных,получавших только ЛПС. Таким образом, результаты наших исследований показывают, что инъекция ЭПО за 30 минут до введения ЛПС через -зависимый механизм улучшает процессы оксигенации тканей и прооксидантно-антиоксидантное состояние организма. 15877 1 2012.06.30 Препарат рекомбинатного человеческого эритропоэтина- улучшает показатели кислородтранспортной функции крови, снижает интенсивность свободнорадикальных процессов и повышает антиоксидантную защиту организма при окислительном стрессе, что может быть использовано для уменьшения окислительных повреждений. Источники информации 1. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лабораторное дело. - 1983. -3. - С. 33-36. 2. Захаров Ю.М. Неэритропоэтические функции эритропоэтина // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. - 2007. - Т. 93. -6. - С. 592-607. 3. Зинчук В.В., Борисюк М.В. Роль кислородсвязующих свойств крови в поддержании прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма // Успехи физиол. наук. - 1999. Т. 30. -3. - С. 38-48. 4. Киричек Л.Т., Зубова Е.О. Молекулярные основы окислительного стресса и возможности его фармакологической регуляции // Международный мед. журнал. -2004.1. - С. 144-148. 5. Королюк М.А. и др. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. -1. - С. 16-19. 6. Рагино Ю.И. и др.Применение новых биохимических способов для оценки окислительно-антиоксидантного потенциала липопротеинов низкой плотности // Клин. лаб. диагн. - 2005. -4. - С.11-15. 7. Соодаева С.К. Окислительный стресс и антиоксидантная терапия при заболеваниях органов дыхания // Пульмонология. - 2006. -5. - С. 122-126. 8. Тибирькова Е.В., Косолапов В.А., Спасов А.А. Антиоксидантные и мембранопротекторные свойства тролокса // Экспер. и клинич. фармалогия. - 2009. - Т. 72. -2. - С. 47-50. 9.,//. . . - 2007. - . 43. - . 5. - . 645-657. 10... Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4