Способ выделения темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕМОЗОЛОМИДА ИЗ ЕГО СОЛЬВАТА С ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДОМ(71) Заявители Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусский государственный университет(72) Авторы Матюшенков Евгений Александрович Козырьков Юрий Юрьевич Юркштович Татьяна Лукинична Бычковский Павел Михайлович Беляев Сергей Александрович(73) Патентообладатели Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусский государственный университет(57) Способ выделения темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом, при котором сольват темозоломида с диметилсульфоксидом кипятят в смеси ацетона и воды при объемном соотношении ацетонвода, равном 4,81, в которую добавлена соляная кислота в количестве 5-25 мольныхотносительно сольвата, охлаждают и фильтруют. Изобретение относится к органической химии, в частности к химии гетероциклических фармакологически активных соединений, конкретно к 4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8 пентазабицикло 4,3,0 нона-2,7,9-триен-9-карбоксамиду (темозоломиду). Темозоломид - гетероциклическое соединение из ряда имидазотетразинов, обладающее противоопухолевой активностью и применяющееся для лечения злокачественных глиом, меланом и других форм злокачественных опухолей 1. Темозоломид - бесцветное кристаллическое вещество, малорастворимое в воде, умеренно растворимое в диметилсульфоксиде. Темозоломид устойчив в кислой среде (5) и лабилен в основной(7), поэтому может применяться перорально. При физиологичесих значенияхтемозоломид спонтанно гидролизуется в 5-(3-метилтриазен-1-ил)имидазол-4-карбоксамид и затем фрагментируется в 5-аминоимидазол-4-карбоксамид и катион метилдиазония, который является метилирующим агентом в отношении молекул ДНК 2-4. Удобным методом получения темозоломида является циклоприсоединение метилизоцианата к 5(4)-диазоимидазол-4(5)-карбоксамиду, доступному из 5(4)-аминоимидазол-4(5)карбоксамида 5-7. Реакцию проводят в среде диметилсульфоксида (ДМСО), и для применения в качестве лекарственного средства выделяемый продукт требует дополнительной очистки. Так, при воспроизведении описанной методики нами было обнаружено, что 16415 1 2012.10.30 выделяемый темозоломид представляет собой сольват с ДМСО с мольным соотношением темозоломидДМСО 11, в то время как в медицинской практике используется не содержащий ДМСО темозоломид. Прототипом изобретения является метод очистки темозоломида, описанный в патенте 6. Авторы очищали темозоломид, полученный реакцией 5(4)-диазоимидазол-4(5)карбоксамида с метилизоцианатом в среде ДМСО, перекристаллизацией из водного ацетона (соотношение водаацетон 13 или 15). Недостатком метода перекристаллизации из смеси ацетон-вода является, во-первых,использование больших объемов растворителя вследствие относительно низкой растворимости в нем темозоломида. Кроме того, нами было обнаружено, что при перекристаллизации из этой системы растворителей мультиграммовых количеств сольвата темозоломида с ДМСО, полученного реакцией 5(4)-диазоимидазол-4(5)-карбоксамида с метилизоцианатом в среде ДМСО, наблюдается сильное потемнение раствора и выпадение окрашенных кристаллов темозоломида. Задачей настоящего изобретения является разработка улучшенной методики выделения темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом, полученного реакцией 5(4)диазоимидазол-4(5)-карбоксамида с метилизоцианатом в среде ДМСО, за счет повышения степени чистоты получаемого продукта. Поставленная задача решается тем, что выделение темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом проводят кипячением в смеси ацетона и воды при объемном соотношении ацетонвода, равном 4,81, в которую добавлена соляная кислота, с последующим охлаждением и фильтрованием при этом получается темозоломид в виде кристаллического порошка. Изобретение иллюстрируют фигуры, таблицы, примеры. Фиг. 1 - спектры ЯМР 1 Н (400 МГц, 2) в области 0-10 м.д. стандартного образца темозоломида от(вверху) и после перекристаллизации сольвата темозоломида с ДМСО из смеси ацетонвода 4,81 с добавлением соляной кислоты (внизу). Фиг. 2 - ИК-спектры стандартного образца темозоломида от(вверху) и после перекристаллизации сольвата темозоломида с ДМСО из смеси ацетонвода 4,81 с добавлением соляной кислоты (внизу). Фиг. 3 - микрофотография образца темозоломида, полученного после перекристаллизации сольвата темозоломида с ДМСО из смеси ацетонвода 4,81 с добавлением соляной кислоты. Пример 1. Выделение темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом в водном ацетоне(15 мольных). В круглодонной колбе емкостью 12 л нагревают до кипения смесь 3,3 л ацетона, 0,69 л дистиллированной воды и 4,8 мл (около 15 мольныхв расчете на сольват темозоломи 2 16415 1 2012.10.30 да) концентрированной соляной кислоты. В кипящую смесь добавляют в один прием 108,68 г сольвата темозоломида с ДМСО и кипятят при перемешивании до полного растворения кристаллов (30-40 мин). Раствору дают самопроизвольно охладиться до комнатной температуры при перемешивании, затем охлаждают в бане с ледяной водой при перемешивании до температуры 1-2 С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Выделившиеся кристаллы фильтруют на стеклянном фильтре с пористой стеклянной пластиной (фильтр Шотта) и размером пор 100 (3) в вакууме водоструйного насоса. Кристаллы последовательно промывают на фильтре при отключенном вакууме ацетоном (125 мл) и затем диэтиловым эфиром (125 мл). После каждой промывки растворитель отделяют фильтрованием в вакууме. После финального фильтрования продукт сушат на фильтре продуванием воздуха с помощью водоструйного насоса в течение 1 ч, затем переносят в круглодонную колбу и сушат в течение 30 мин при остаточном давлении 2-4 мм рт. ст. в водяной бане с температурой воды 40 С. Получается 63,28 г 4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8 пентазобицикло 4,3,0 нона-2,7,9-триен-9-карбоксамида (темозоломида) в виде белого крупнокристаллического порошка. Выход 81-84(в расчете на содержание темозоломида в сольвате 69-72 ). Спектр ЯМР 1 (2, 400 МГц), , м.д. 4,01 с (3), 8,65 с (1). Спектр ЯМР 1 (ДМСО-6, 400 МГц), , м.д. 3,83 с (3), 8,59 с (1), 7,55 с (1), 7,87 с(1). ИК (таблетка , см-1) 3422, 3389, 3188, 3114, 1758, 1759, 1733, 1679, 1601, 1453,1403, 1355, 1266, 1218, 1043, 949, 737, 731, 711, 634, 568, 513. Пример 2. Выделение темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом в водном ацетоне(5 мольных). Выделение темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом проводили по методике, описанной в примере 1, с использованием 1,6 мл (5 мольныхв расчете на сольват темозоломида) соляной кислоты. Выход и спектральные данные полученного продукта соответствовали указанным в примере 1. Пример 3. Выделение темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом в водном ацетоне(25 мольных). Выделение темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом проводили по методике, описанной в примере 1, с использованием 8,0 мл (25 мольныхв расчете на сольват темозоломида) соляной кислоты. Выход и спектральные данные полученного продукта соответствовали указанным в примере 1. Образцы темозоломида, полученные в соответствии с примерами 1-3, охарактеризованы методами ЯМР и ИК-спектроскопии, проведен сравнительный анализ с помощью ВЭЖХ, определены температуры плавления, получены микрофотографии образцов кристаллов. Спектры ЯМР 1 полученных образцов были записаны дейтерированной воде или ДМСО-6 на приборе 400 с рабочей частотой 400 МГц. Химические сдвиги измерялись по шкалеотносительно сигнала ацетона (2,22 м.д.) и метанола (3,34 м.д.) в дейтерированной воде. ИК-спектры веществ снимались на приборе 70 в таблетках из бромида калия. Хроматографическое исследование проводилось с использованием жидкостного хроматографа 1200, укомплектованного детектором на основе диодной матрицы, термостатом колонок, колонкой для хроматографии-18 (1504,6 мм,размер зерна 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовался раствор, содержащий 0,5 уксусной кислоты/ацетонитрил/триэтиламин в соотношении (об. ) 96,9/3/0,1 соответственно. Скорость подвижной фазы - 1 мл/мин. Температура хроматографической колонки - 25 С. Детектирование осуществлялось при 254 нм. В качестве стандарта использовался образец темозоломида производства компании . 3 16415 1 2012.10.30 Морфологию структурных элементов изучали с использованием сканирующего электронного микроскопа 1420. Температуру плавления определяли на приборе(. 9612) в стеклянных капиллярах с внутренним диаметром 1 мм, запаянных с одного конца. Взвешивание веществ и образцов проводили на весах ВЛР-1, заводской 86. Спектроскопия ЯМР. В спектре ЯМР 1 (2) полученных образцов очищенного темозоломида наблюдаются характерный синглет от протонов метильной группы при 4,01 (3) и синглет от протона имидазольного кольца при 8,65 (1), что согласуется с данными литературы. Полученный ЯМР 1 Н спектр соответствовал снятому в тех же условиях спектру стандартного образца темозоломида, приобретенного у компании(фиг. 1). Спектр ЯМР 1 (2) сольвата темозоломида с ДМСО дополнительно содержит характерный синглет от протонов ДМСО при 2,72 м.д. После перекристаллизации сольвата темозоломида с ДМСО из водного ацетона или его кипячения с сухим ацетоном интенсивность сигнала от протонов ДМСО в спектре значительно уменьшается. Так, на фиг. 1 приведены спектры ЯМР 1 стандартного образца темозоломида от(вверху) и образца после перекристаллизации сольвата темозоломида с ДМСО из смеси ацетонвода 4,81 с добавлением соляной кислоты (внизу). В качестве внутреннего стандарта для определения химического сдвига использовался метанол (синглет при 3,34 м.д.). Соотношение интегральных интенсивностей сигналов метильной группы темозоломида(4,01 м.д.) к сигналу метальных групп ДМСО (2,72 м.д.) в спектре неочищенного сольвата составляет около 12, что соответствует мольному соотношению темозоломид ДМСО 11. После очистки кристаллизацией из водного ацетона соотношение интегральных интенсивностей составляет около 1501, что соответствует мольному соотношению темозоломидДМСО 3001 и массовому соотношению 7501 (около 0,13 по массе остаточного ДМСО). ИК-спектроскопия. В ИК-спектрах полученных образцов очищенного темозоломида наблюдались характерные полосы поглощения карбонильных групп при 1679, 1733 и 1759 см-1 и полосы поглощенияамидной группы при 3114, 3388 и 3422 см-1. ИКспектр синтезированного образца темозоломида соответствовал ИК-спектру стандартного образца темозоломида, приобретенного у компании(фиг. 2), в том числе в области отпечатков пальцев. Кроме того, полученный ИК-спектр соответствовал приведенному в литературе 6. Температура плавления. Для оценки индивидуальности и чистоты полученных образцов очищенного темозоломида проводили сравнение их температур плавления с литературными данными и с температурой плавления стандартного образца, приобретенного у компании , в одинаковых условиях. В патенте 8 и статье 9 имеется указание, что темозоломид плавится при температуре 210 С и темнеет при температуре от 160 до 210 С. Нами было обнаружено, что изменение цвета образца сильно зависит от скорости нагревания. Так, при быстром нагревании до 185 С (20 С в минуту) синтезированного и очищенного образца темозоломида при достижении температуры 165-170 С он начинает приобретать желтовато-розовый цвет и при дальнейшем нагреве до 185 С окраска углубляется. При последующем медленном нагревании (1 С в минуту) образец становился темно-коричневым и затем почти черным при достижении температуры 193-196 С. Признаков плавления образца при этом замечено не было. Если же постоянно проводить быстрый нагрев образца (20 С в минуту) до температуры 230 С, то его почернение происходит при температуре 205-212 С без признаков плавления. Аналогичные свойства проявлял стандартный образец от компании . Определение температуры плавления или разложения темозоломида не может служить строгим критерием оценки его чистоты, так как зависит от скорости нагрева образца. Анализ с использованием ВЭЖХ. 4 16415 1 2012.10.30 Время выхода пиков на хроматограммах полученного соединения совпадало с временем выхода пика темозоломида на хроматограмме вещества сравнения , отклонение составляло не более 0,5 . Заявляемый способ обеспечивает получение высокоочищенного темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом, полученного реакцией 5(4)-диазоимидазол-4(5)карбоксамида с метилизоцианатом в среде ДМСО. Окраска кристаллов отсутствует. Источники информации 1., ,/ ... . -,., 2003. - 164 . 2.,,,.,.,.,., .,,,,.,.,. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6