Способ определения содержания белка в семенах льна масличного

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В СЕМЕНАХ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Титок Владимир Владимирович Хотылева Любовь Владимировна Корень Лидия Васильевна Вакула Светлана Ивановна Леонтьев Виктор Николаевич Шостак Людмила Михайловна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56) Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - М. Колос, 1985. - С. 7-11.1508996 1, 1989.1347015 1, 1987. ГОСТ 10846-91. Зерно и продукты его переработки. Метод определения белка.(57) Способ определения содержания белка в семенах льна масличного, отличающийся тем, что осуществляют термогравиметрический анализ образца, представляющего собой выделенные из семян семядоли с зародышами, в интервале температур 25-700 С, причем скорость нагревания образца массой 5,0-5,1 мг составляет 5 С/мин, расход воздуха 200 мл/мин, и по полученной кривой потери массы образца в интервале температур 230370 С определяют содержание белка в семенах. Изобретение относится к области биохимии растений, в частности к методам определения запасных веществ семян, что необходимо при создании сортов с заданными качественными характеристиками семян. Изобретение может использоваться для ускоренного и экономичного определения содержания белка в семенах селекционных образцов и сортов льна масличного, а также для оценки кормовой ценности семян льна при использовании в животноводстве, определении ценности семян для пищевой, медицинской и парфюмерной промышленности. Известны методы определения белка, такие как метод Кьельдаля 1, 2, фотометрическое определение азота 2, 3, 4, колориметрический метод определения белка по Лоури в модификации Хартри 2, 5, 6, биуретовый микрометод 2, 7, 8, метод Брэдфорда 9. Все эти методы основаны на сложных химических реакциях и представляют собой весьма трудоемкий и продолжительный анализ. Фотометрическое определение азота 2, 3, 4 основано на сжигании органического вещества концентрированной серной кислотой совместно с ртутным катализатором с последующим образованием красителя - индофенола голубого в результате реакции сернокислого аммония с салицилатом-гипохлоритом в присутствии нитропруссида. Опти 13275 1 2010.06.30 ческую плотность раствора определяют на ФЭК-56 М при 578 нм. Количество азотав образце рассчитывают по формуле х 100/1 1 н, где- оптическая плотность опытного раствора 1 - оптическая плотность стандартного раствора- общий объем(5 см 3) 1 - объем, взятый для проведения реакции (0,05 см 3) н - масса навески, мг а содержание азота в 1 см 3 стандартного раствора (0,2 мг). За рабочий день можно определить азот в 50 образцах. Метод Лоури - один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Лоурив 1951 году 5. Используемый в настоящее время метод Лоури в модификации Хартри 2, 5, 6 основан на реакции белков с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), дающей синее окрашивание. В щелочной среде ионы С 2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в . Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина, образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Интенсивность окраски определяют на ФЭК-56 М с красным светофильтром или на спектрофотометре при 750 нм. Количество белка в растворе находят по калибровочной кривой. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку - 10100 мкг/мл. Биуретовый метод (микрометод) - один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе 2, 7, 8. Разработан в 1949 году Горналлом, Бардавиллом и Дэвидом, ныне мало используется в биохимической лабораторной практике (за исключением медицинских анализов на белок) из-за низкой чувствительности. Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют так называемый биуретовый реактив,состоящий из КОН, 4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют при 540-560 нм. Количество белка высчитывают на основании предварительно составленной калибровочной кривой по яичному альбумину или по чистому водорастворимому препарату растительного белка. К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность. Чувствительность метода - 2-10 мг/мл. Метод Бредфорда - один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Мерион Бредфорд в 1976 году 9. Метод основан на реакции красителя кумассис аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом, увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм,пропорционально количеству белка в растворе. Метод дает хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения адсорбции от концентрации, в целом чувствительность метода зависит от соотношения концентраций определяемого белка и красителя чем больше красителя,тем чувствительней метод), менее капризный по сравнению с методом Лоури. Наиболее близким к заявляемому способу является классический способ определения белка в растительном материале листьях, стеблях, клубнях, семенах - микрометод определения общего азота, разработанный в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем, который впоследствии был назван его именем 1. Этот метод до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа 13275 1 2010.06.30 сырья и готовой продукции, отличается наибольшей точностью и используется в качестве стандарта, несмотря на его сложность. Микрометод Кьельдаля основан на минерализации навески анализируемого материала в присутствии концентрированной серной кислоты, в результате чего все органические вещества окисляются, а выделяющийся аммиак связывается серной кислотой. После этого аммиак отгоняют со щелочью и по количеству выделившегося аммиака вычисляют количество азота в исследуемом материале. В анализ берется навеска растительного материала, содержащая 10 мг азота. При анализе семян зерновых культур навеска составляет 0,30,4 г, при анализе семян льна - 0,1 г. Ход определения включает взятие навески растительного материала, ее измельчение, определение влажности путем высушивания до абсолютно сухого веса, сжигание в колбе Кьельдаля концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора - 0,5 г смеси 244(100102). Содержимое колбы кипятят на слабом огне до полного обесцвечивая (1-2 дня). По окончании сжигания аммиак отгоняют со щелочью в аппарате Кьельдаля, выделяющийся аммиак поглощается в приемнике 0,02 раствором серной или борной кислоты с образованием сульфата или бората аммония. Затем содержимое приемника после отгонки титруют 0,02 до зеленой окраски. Таким способом определяем остаток аммиака, не связанный с серной кислотой. Производим расчет общего азота с учетом процента сухого вещества в навеске. Содержание белка в материале определяют, умножая содержание общего азота на соответствующий коэффициент. По Конореву этот коэффициент для зерна пшеницы и ячменя составляет 5,70 для риса - 5,95 для овса и ржи - 5,83 сои - 5,71 арахиса - 5,46 подсолнечника, льна и хлопчатника - 5,30. Метод Кьельдаля - очень трудоемкий и продолжительный анализ, поэтому нами предлагается более удобный современный способ определения белка с использованием термогравиметрического анализа растительного материала на термоанализаторе ТА-4000 (модуль ТГ-50) (,Швейцария). Задачей предлагаемого изобретения является ускорение анализа образцов, уменьшение используемых проб материала от 100 до 5,0-5,1 мг, упрощение процесса анализа. Способ основан на процессе изменения массы образца в зависимости от температуры с выделением газообразных продуктов. Метод термического анализа - динамическая термогравиметрия, или просто термогравиметрия (ТГ), регистрирует изменение массы образца в зависимости от температуры. Экспериментально получаемая кривая зависимости изменения массы от температуры(термогравиметрическая кривая) позволяет судить о термостабильности и составе образца в начальном состоянии, о термостабильности и составе веществ, образующихся на промежуточных стадиях процесса, и о составе остатка, если таковой имеется. Среди многочисленных областей термогравиметрии можно выделить термическое разложение веществ с выделением газообразных продуктов, что может быть использовано как метод анализа запасных компонентов семян растений. Кривая, полученная термогравиметрическим анализом, указывает на постепенное снижение биомассы исследуемого объекта за счет последовательной термодеградации компонентов семядолей в первом температурном диапазоне (25-100 С) - воды во втором(100-230 С) - легколетучих веществ в третьем (230-370 С) - протеинов (белков) в четвертом (370-460 С) - жирных кислот в пятом (460-530 С) - нуклеиновых кислот и свободных нуклеотидов в шестом (530-700 С) - лигниноподобных компонентов в седьмом зольный остаток, содержащий оксиды металлов (фигура). Методы термического анализа получили в настоящее время широкое распространение, как в научных исследованиях, так и в производственной практике, благодаря высокой чувствительности и объективности при оценке термических характеристик вещества 1014. Эти методы позволяют получать ценную информацию о строении, составе и свойствах твердых тел и жидкостей различной природы, о физических и химических процессах,3 13275 1 2010.06.30 протекающих в них при нагревании и охлаждении. В последние годы методы термического анализа, в частности термогравиметрия, стали успешно использоваться для изучения физико-механических свойств высокомолекулярных соединений, в том числе и запасных компонентов семян растений. Заявленный способ определения белка позволяет повысить скорость анализа, уменьшить массу используемых проб материала, упростить процесс анализа по сравнению с микрометодом определения белка по Кьельдалю. Сущность заявляемого способа определения белка в семенах льна масличного заключается в том, что осуществляют термогравиметрический анализ образца, представляющего собой выделенные из семян семядоли с зародышами, в интервале температур 25700 С, причем скорость нагревания образца массой 5,0-5,1 мг составляет 5 С/мин, расход воздуха - 200 мл/мин, и по полученной кривой потери массы образца в интервале температур 230-370 С определяют содержание белка в семенах. Термогравиметрический анализ проводят на термоанализаторе ТА-4000 (модуль ТГ-50) (, Швейцария). Содержание белка в образце рассчитывают при помощи программного обеспечения . Кривые термогравиметрического анализа семядолей семени сортапредставлены на фигуре. Обработка результатов эксперимента, заложенная в программе , позволяет выполнить математические преобразования кривой потери массы - ТГ (ДТГ) произвести расчеты потери массы в зависимости от температуры и времени нагревания определить ступени потери массы с горизонтальными или касательными базовыми линиями таблицу точек (в процентах или миллиграммах) любой части кривой потери массы увеличение размеров выделенных участков ТГ-кривой сравнение полученных ТГ-кривых возможен изостатический и динамический нагрев образца. О генотипических особенностях кривых термогравиметрического анализа можно судить по величине энергии активации процесса горения исследуемого компонента. Предлагаемый способ определения белка реализован при исследовании семядолей с зародышем без кожуры 19 сортов льна масличного. Термогравиметрический анализ микрообразцов (5,0-5,1 мг) проводили на термоанализаторе ТА-4000 (модуль ТГ-50) (, Швейцария) в интервале температур 25-700 С при скорости нагревания 5 С/мин и расходе воздуха 200 мл/мин. Кривые потери массы были рассчитаны при помощи программного обеспечения . Потеря массы образца в интервале температур 230-370 С указывала на содержаниев нем протеинов, которые распадаются в данном диапазоне температур. В таблице представлены данные по содержанию белка в семенах сортов льна масличного урожая 2006 года, полученные заявляемым способом и микрометодом Кьельдаля. Содержание белкав семенах образцов льна масличного урожая 2006 года,определенное термогравиметрическим методом (термоаналитическая система ТА-4000, Швейцария) и микрометодом Кьельдаля(приведены средние величины из трех биологических повторностей) Термогравиметрия Сорта льна Микрометод Кьельдаля Еа (энерг. активации),(семядоли)белкабелка кДж/моль 13275 1 2010.06.30 Продолжение таблицы Сорта льна Достоверная корреляция между данными, полученными заявляемым способом, и данными, полученными классическим методом Кьельдаля, отличающимся наибольшей точностью, составила 0,80 (Р 0,01), что свидетельствует об эффективности заявляемого способа. Источники информации 1. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - М. Колос, 1985. - С. - 5-9. 2. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. - Л. Колос, 1987. - 455 с. 3../ // . . . - 1976. - . 61. - . . . 107-109. 4. Перуанский Ю.В., Савич И.М., Хван А.И. // Вестник с.-х. науки Казахстана. - 1979.1. - С. 31-34. 5.О,,,// . . . - 1951. - . 193. - . 265. 6..// . . - 1972. - . 48. - . 2. - . 422-427. 7. Бэйли Дж. Методы химии белков. - М., 1965. - 284 с. 8. Доссон Р. Справочник биохимика. - М. Мир, 1991. 9.// . . - 1976. - . 72. . 248-254. 10. - ,(.)// -. - 2002. - . 77. - . 4. - . 495502. 11.,В., - (.) //. 2005. - . 90. - . 1-2. - . 271-279. 12.,.-//. - 1993. - . 48. .2. - . 109-114. 5 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6