Способ выделения диглюкозида секоизоларицирезинола из семян льна масличного

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДИГЛЮКОЗИДА СЕКОИЗОЛАРИЦИРЕЗИНОЛА ИЗ СЕМЯН ЛЬНА МАСЛИЧНОГО(71) Заявитель Учреждение образования Белорусский государственный технологический университет(72) Авторы Стасевич Ольга Викторовна Михаленок Сергей Георгиевич(73) Патентообладатель Учреждение образования Белорусский государственный технологический университет(57) Способ выделения диглюкозида секоизоларицирезинола из семян льна масличного,при котором проводят обезжиривание измельченного льняного семени, обезжиренную массу подвергают экстракции 50 -ным водным раствором этанола, которая совмещена со щелочным гидролизом, при воздействии микроволнового излучения мощностью 150 Вт в течение 2 минут шестикратно с перерывом в 1 минуту, затем осуществляют нейтрализацию и концентрирование полученного экстракта и очистку концентрата путем препаративной хроматографии, причем на первом этапе очистку осуществляют на сорбенте-20 с использованием в качестве подвижной фазы водного раствора этанола со ступенчато возрастающим градиентом концентрации (10, 15, 20, 40 ), а на втором этапе очистки применяют обращенно-фазный сорбент силикагель С 18. Настоящее изобретение касается способа выделения лигнана диглюкозида секоизоларицирезинола (СДГ) из семян льна масличного, фенольного природного соединения, обладающего широким спектром биологической активности. Лигнан СДГ является мощным антиоксидантом, более того, благодаря своей структуре, схожей с эндогенными эстрогенами млекопитающих, является фитоэстрогеном. Лен масличный ( ) является богатым источником лигнана СДГ. Это растение широко культивируется на территории Республики Беларусь, поэтому является доступным и недорогим сырьем для получения этого биологически активного соединения. Способы, применяемые при выделении различных компонентов из растительных объектов, имеют большое значение не только с точки зрения выхода получаемых соединений,а также с точки зрения чистоты полученных препаратов, возможности применения экологически безопасных растворителей в процессе их получения, а также возможности сокращения продолжительности процесса выделения. 12697 1 2009.12.30 Обычный способ получения лигнана СДГ осуществляют по схеме, включающей в себя несколько стадий обезжиривание измельченного льняного семени, его экстракцию, гидролиз с последующей нейтрализацией и концентрированием полученного экстракта, а затем очистку концентрата с применением препаративной хроматографии 1-3. Стадия обезжиривания необходима для удаления липидов и облегчения процесса экстракции фенольных компонентов льняного семени. Наиболее важными стадиями являются гидролиз и экстракция, так как именно они определяют выход экстракта и продолжительность процесса. Проведение стадии гидролиза необходимо и обязательно,т.к. диглюкозид секоизоларицирезинола находится в связанном олигомерном состоянии вместе с гидроксиметилглутаровой кислотой в льняном семени 1. Самым эффективным способом проведения стадии гидролиза является щелочной. Существуют различные подходы к выбору экстрагента. Применение системы диоксанэтанол 1 и метанол-вода 2 позволяет получить в экстракте удовлетворительное содержание СДГ, применение системы ацетон-вода 4 дает также возможность получить высокий выход экстрактивных веществ, но из-за высокой токсичности вышеперечисленных растворителей эти методы недостаточно безопасны для реализации. Наиболее экологически безопасным экстрагентом является водный этанол 4, кроме того, водно-спиртовая система дает возможность избавиться уже на стадии экстракции от нежелательных цианогенных гликозидов, присутствующих в льняном семени. Этап выделения чистого препарата СДГ осуществляется проведением процесса хроматографической очистки полученного СДГ-содержащего экстракта. Преобладающим методом для хроматографического разделения СДГ-содержащего экстракта является использование силикагеля. Несмотря на то, что чистота и выход СДГ при использовании этого сорбента удовлетворительные, существует проблема безопасности применения летучих токсичных растворителей в качестве подвижной фазы, таких как метанол и хлороформ 5-7. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ 8, который включает в себя стадию удаления липидов из измельченного льняного семени, совмещенный процесс водно-этанольной экстракции и щелочного гидролиза обезжиренной массы с последующей нейтрализацией и концентрированием полученного экстракта, а также двукратного разделения концентрата с применением ионообменного сорбента-20. Недостатки данного способа - относительно высокая продолжительность процесса выделения лигнана СДГ и недостаточная чистота выделенного препарата для использования его в качестве лекарственного средства или объекта для биохимических исследований. Задачей изобретения является повысить чистоту получаемого препарата СДГ с применением эффективного экологически безопасного способа. Задача решается тем, что способ выделения диглюкозида секоизоларицирезинола из семян льна масличного, при котором проводят обезжиривание измельченного льняного семени, обезжиренную массу подвергают экстракции 50 -ным водным раствором этанола, которая совмещена со щелочным гидролизом, при воздействии микроволнового излучения мощностью 150 Вт в течение 2 мин шестикратно с перерывом в 1 мин, затем осуществляют нейтрализацию и концентрирование полученного экстракта и очистку концентрата путем препаративной хроматографии, причем на первом этапе очистку осуществляют на сорбенте-20 с использованием в качестве подвижной фазы водного раствора этанола со ступенчато возрастающим градиентом концентрации (10, 15, 20, 40 ), а на втором этапе очистки применяют обращенно-фазный сорбент силикагель С 18. Изобретение поясняется примерами, представленными ниже. Пример 1. В качестве материала для исследования использовали семена льна масличного сорта. Льняное семя массой 117 г измельчали в электрической кофемолке и обезжири 2 12697 1 2009.12.30 вали гексаном в течение 4 ч в аппарате Сокслета. К обезжиренной массе добавляли 1 000 мл 50 водного этанола и 40 мл 4 М водного раствора , суспензию подвергали обработке микроволновым излучением мощностью 150 Вт в течение 2 мин шестикратно с перерывом в 1 минуту. Экстракт отделяли от экстрагируемой массы центрифугированием. Полученный экстракт подкисляли до рН 3-4 6 М раствором НС и упаривали при пониженном давлении при температуре, не превышающей 45 С. Пример 2. 15 г экстракта растворяли в 125 мл воды и вносили в колонку с ионообменником-20 (колонка с внутренним диаметром 2,5 см и высотой 34 см). После промывания 300 мл воды колонку элюировали возрастающим ступенчатым градиентом водного этанола (10, 15, 20, 40 ) при скорости протока 5 мл/мин. При промывании колонки 20 этанолом элюировались наиболее чистые фракции,содержащие СДГ, которые собирали, концентрировали и подвергали дальнейшей очистке на обращенно-фазном силикагеле С 18. Остальное количество СДГ с примесями вымывали 40 этанолом, собирали и подвергали рехроматографии. В качестве элюирующей системы при окончательной очистке на обращенно-фазном силикагеле С 18 (колонка с внутренним диаметром 2 см и высотой 34 см) использовали также возрастающий ступенчатый градиент водного этанола (10, 25, 50 ) при скорости протока 1 мл/мин. СДГ-содержащие фракции с чистотой 95 элюировались 25 этанолом. Одной из отличительных черт изобретения, по сравнению с 8, является проведение совмещенного процесса экстракции и гидролиза при использовании микроволновой энергии, что дало возможность сократить процесс получения СДГ-содержащего экстракта (обработка суспензии осуществляется в течение 2 мин шестикратно с перерывом в 1 минуту,мощность излучения - 150 Вт) в 4 раза. Способ хроматографического разделения СДГсодержащего экстракта по изобретению отличается от способа, описанного ранее 8, тем,что на первом этапе очистки экстракта на сорбенте-20 в качестве подвижной фазы используют возрастающий ступенчатый градиент концентрации водного этанола, а на втором этапе очистки применяют обращенно-фазный силикагель, что дает возможность повысить чистоту получаемого препарата с 91 до 95 . Задача изобретения решена в полном объеме, так как данный способ дает возможность получить препарат лигнана диглюкозида секоизоларицирезинола с чистотой 95 ,при этом используются экологически безопасные растворители и снижается продолжительность процесса выделения в 4 раза. Выделенное вещество может применяться в качестве биологически активной добавки к пище в целях профилактики заболеваний, связанных со снижением антиоксидантного потенциала организма, для профилактики гормонозависимых заболеваний, а также может найти применение в медицине в качестве лекарственного средства. Полученное соединение может применяться непосредственно как исходное вещество для получения его структурных аналогов, а также использоваться в качестве объекта в биохимических исследованиях. Осуществление изобретения возможно в области фитохимической промышленности, в частности на предприятиях концерна Белбиофарм. Источники информации 1...// . .. - 2000. - . 48. - . 5216-5219. 2...// .-. . . - 2000. - . 33. - . 268-275. 3. Патент США 005705618, МПК 07 1/00,08 97/00, 1998. 3 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4