Средство для подавления ВИЧ в культуре клеток

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ВИЧ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК(71) Заявители Белорусский государственный университет Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Гасич Елена Леонидовна Еремин Владимир Федорович Ксендзова Галина Анатольевна Полозов Генрих Иванович Сорокин Виктор Леонидович Шадыро Олег Иосифович(73) Патентообладатели Белорусский государственный университет Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Государственное учреждение Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь для подавления ВИЧ в культуре клеток. Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и касается средств, обладающих активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), этиологического агента ВИЧ-инфекции и ее последней стадии СПИДа (синдром приобретенного иммунного дефицита). В настоящее время основной стратегией лечения ВИЧ-инфекции (СПИДа) является комбинированное применение этиотропных лекарственных средств, подавляющих репликацию вируса иммунодефицита человека 1. Однако высокая стоимость этиотропной терапии (до 10 тыс.в год) делает ее труднодоступной. 11933 1 2009.06.30 Известно использование -(3,5-ди-трет-бутил-2-гидроксифенил)-4-метилбензолсульфонамида в качестве промежуточного продукта для получения катализатора при полимеризации олефинов 2. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих активностью против ВИЧ-инфекции (СПИДа). Поставленная задача достигается применением ранее известного соединения -(3,5-дитрет-бутил-2-гидроксифенил)-4-метилбензолсульфонамида для подавления ВИЧ в культуре клеток. Авторами обнаружены неочевидные свойства, позволяющие применить его для подавления ВИЧ-инфекции в культуре клеток. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1 Определение максимально переносимой концентрации (МПК) заявляемого вещества в культуре клеток . Клетки выращивали в среде роста 1640 (без фенолового красного), содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 0,02 мМ -глутамина, 50 мкг/мл тилозина. Заявляемое вещество в концентрации 10 мг/мл растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и затем добавляли чистую среду 1640 (конечная концентрация Д - 10 ). В лунки 96-луночных планшетов разливали по 100 мкл готовой среды роста 1640 и добавляли заявляемое вещество в исходной концентрации 10 мг/мл. После этого проводили титрование заявляемого вещества 4-кратным шагом (1/4 1/16 1/64 1/256 и т.д.). После раститровки заявляемого вещества во все лунки были добавлены клеткив концентрации 300 тыс. кл/мл. В нечетные ряды планшета добавляется вирус в рабочем разведении(определение протективных свойств вещества), в четных рядах вируса нет (определение токсического действия вещества). Все исследования проводили в дубликатах (по 2 лунки для определения каждого параметра). 6 лунок остаются с клетками - контроль клеток, а в другие 6 лунок добавляется вирус в рабочем разведении - контроль вируса. Планшеты помещают к термостат при 37 С с 5 СО 2 на 5 суток. По истечении указанного времени во все лунки планшета добавляется МТТ (3-(4,52-)-2,5 (, ) в концентрации 7,5 мг/мл, планшеты оставляют на 4 часа в термостате при 37 С. По истечении указанного времени во все лунки добавляли растворитель(ДМСО), выдерживали 10 минут, покачивая планшет, после чего проводили учет с помощью спектрофотометра-ридера при длине волны 540-690 нм. Оптимальная концентрация МТТ (3-(4,52-)-2,5 (, ) составила 7,5 мг/мл. Ингибирующая концентрация (С 50) рассчитывалась по формуле(ОПкк)(ОПкв) где ОПпв - оптическая плотность в лунке с препаратом и вирусом ОПкв - оптическая плотность в лунке с контролем вируса (без препарата) ОПкк - оптическая плотность в лунке с чистыми клетками без вируса и без препарата. Результаты исследований представлены в таблице. 11933 1 2009.06.30 Определение анти-ВИЧ активности заявляемого соединения Концентрация препарата, инфицированныхзащиты мкг/мл клеток 1 1/64 234,0 88,0 12 2 1/256 59,0 69,4 27 3 1/1024 14,6 61,0 32 4 1/4096 3,7 55,5 41 Разведение 1/32 можно рассматривать как максимально токсическую концентрацию. 50 препарата составила 3,7 мкг/мл, а химиотерапевтический индекс (ХТИ) равнялся 128. Пример 2 Определение специфической активности вещества (оценка инфицированных клеток). Клетки Е выращивали в среде роста 1640 (без фенолового красного), содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 0,02 мМ -глутамина, 50 мкг/мл тилозина. Вещество в концентрации 10 мг/мл растворяли в ДМСО и затем добавляли чистую среду 1640 (конечная концентрация ДМСО - 10 ). В лунки 96-луночных планшетов разливали по 100 мкл готовой среды роста 1640 и добавляли вещество в исходной концентрации 10 мг/мл. После этого проводили титрование исследуемого вещества 4-кратным шагом (1/4 1/16 1/64 1/256 и т.д.). После раститровки вещества во все лунки были добавлены клеткив концентрации 300 тыс. кл/мл. В нечетные ряды планшета добавляется вирус в рабочем разведении, в четных рядах вируса нет. Все параметры определялись в трех лунках. 6 лунок остаются с клетками - контроль клеток, а в другие 6 лунок добавляется вирус в рабочем разведении - контроль вируса. Планшеты помещают в термостат при 37 С с 5 СО 2 на 5 суток. По истечении указанного времени культуральную жидкость из лунок забирали, переносили в пластиковые пробирки объемом 0,5 мл и клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 7 минут. По истечении указанного времени супернатант культуральной жидкости удаляли, а оставшиеся клетки суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с 7,2-7,4. Процедуру отмывки в ФСБ повторяли дважды при 1000 об/мин 7 минут. После последней отмывки клетки суспендировали в 100 мкл ФСБ и наносили в объеме 70 мкл в лунки предметных стекол. Клетки высушивали на воздухе, после чего фиксировали в охлажденном при - 20 С ацетоне. Затем к зафиксированным на предметном стекле клеткам добавляли иммунную сыворотку, содержащую антитела к ВИЧ в рабочем разведении, и смесь инкубировали во влажной камере при 37 С в течение 30 минут. По истечении указанного времени клетки отмывали трижды в ФСБ, после чего в каждую лунку с клетками добавляли антивидовые антитела (против иммуноглобулинов человека,НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва, Россия), меченые флюоресциинизотиоцианатом(ФИТЦ), и инкубировали во влажной камере при 37 С в течение 30 минут. По истечении указанного времени клетки трижды отмывали ФСБ от несвязавшегося ФИТЦ, подсушивали и исследовали с помощью люминесцентного микроскопа в водной иммерсии. Оценку инфицированных клеток проводили на 100 исследованных. В инфицированных клетках наблюдали изумрудно-зеленое свечение оболочки. Результаты исследований также представлены в таблице. Из представленных в примерах и таблице данных видно, что заявляемое вещество подавляет ВИЧ в культуре клеток.п /п Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.