Способ диагностики опухолевого роста у животного

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА У ЖИВОТНОГО(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Красковский Георгий Васильевич Манина Елена Юрьевна Миронова Галина Ивановна Росецкая Стелла Дмитриевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(56)2489 С 1, 1998.а 19990938, 2001.2003123593 А, 2005. КРАСКОВСКИЙ Г. и др. Инфекция и иммунитет Материалы Республиканской научно-практической конференции, посвященной 75-летию БелНИИЭМ. - Минск Хата, 1999. С. 508-510. КРАСКОВСКИЙ Г.В. Актуальные вопросы иммунологии и аллергологии Материалысъезда Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов. - Гомель Белый ветер,2000. - С. 176-178. КРАСКОВСКИЙ Г.В. и др. Экологическая антропология. - Минск, 2002. С. 307-310.(57) Способ диагностики опухолевого роста у животного путем выявления в сыворотке крови онкотолерогена, представляющего собой иммунный комплекс и специфический для данной опухоли комплекс свободных антигенов, отличающийся тем, что у обследуемого животного проводят реакцию преципитации между сывороткой крови и тест-антителами,полученнымииз обработанных трипсином лимфоидных клеток его селезенки,причем о наличии онкотолерогена судят, если уровень образования иммунных комплексов у обследуемого животного выше, чем в такой же реакции преципитации у здорового животного. Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. Известен способ диагностики опухолевого роста и определения типа опухоли, заключающийся в иммунологическом анализе крови, определения в ней ассоциации факторов,включающих иммунный комплекс, специфический для данной опухоли комплекс свободных антигенов, при анализе в качестве тест-изоантисывороток используют содержащие соответствующий специфическому антигенному комплексу данной опухоли набор антител изоантисывороток, полученных у опухоленосителей с полностью хирургически удаленной у них гомологичной опухолью. Данный способ является прототипом 1. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются анализ крови и определение в 11949 1 2009.06.30 ней ассоциации факторов, включающих иммунный комплекс, специфический для опухоли комплекс антигенов. Однако способ не дает возможности получить тест-антитела без полного удаления опухоли. Задачей заявляемого способа является упрощение способа за счет снятияонкотолерантности. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ диагностики опухолевого роста у животного путем выявления в сыворотке крови онкотолерогена,представляющего собой иммунный комплекс и специфический для данной опухоли комплекс свободных антигенов, когда у обследуемого животного проводят реакцию преципитации между сывороткой крови и тест-антителами, полученнымииз обработанных трипсином лимфоидных клеток его селезенки, причем о наличии онкотолерогена судят,если уровень образования иммунных комплексов у обследуемого животного выше, чем в такой же реакции преципитации у здорового животного. В связи с тем, что для осуществления практически результативной патогенетической(основанной на природе онкопроцесса) диагностики рака необходимо определить истинный патогенетический признак опухоли, специфически отражающий наличие опухоли,опухолевого роста. Для каждой опухоли характерен специфический онкотолероген, который является ее признаком в организме. Опухолевый рост происходит при наличие в организме (сыворотка крови, тканевые жидкости) онкотолерогена и возрастании его количества в процессе опухолевого роста, т.е. при высоком и возрастающем количестве специфического для опухоли комплекса свободных опухолевых антигенов в сыворотке (и асцитической жидкости) на фоне повышенного уровня комплексов антиген-антитело. Обнаружение онкотолерогена свидетельствует о наличии в организме опухоли. При нарушении контакта лимфоидных клеток с онкотолерогеном происходит отмена онкотолерантности, развивается противоопухолевый иммунитет. Представляет важность получение антител (пути их получения), специфически взаимодействующих с онкотолерогеном сывороток и тканевых жидкостей опухоленосителей, что позволит установить его наличие при опухолевом росте и тем самым осуществить эффективную иммунологическую диагностику рака 2. Наш метод является новым, так как позволяет получить реакционноспособный агент (антитела). Литературные источники свидетельствуют о попытках использовать лимфоидные клетки, антитела (природные или измененные человеком) для диагностики или терапии опухолей. Формирование цитолитических Т-лимфоцитов определенным способом позволяет уничтожать опухолевые клетки. Клинические испытания вакцины на основе 7/2-микроглобулинтрансфецированных аутологичных меланомных клеток показали ее способность вызывать всего лишь частичную ремиссию (4 ) или некоторую стабилизацию процесса (18 ) у пациентов с множественной рецидивирующей или резистентной к стандартному лечению меланомой 3. Методом иммуногистохимии с использованием моноклональных антител (МонАТ) к раковоэмбриональному антигену (РЭА) 431/26,1522 и С 7202 исследовали образцы от 37 больных раком уротелия. МонАТ 431/26 проявили лучшую специфичность и чувствительность. В целом максимум 5 опухолевых клеток были позитивны по РЭА. Полагают, что использование МонАТ к РЭА не может быть полезным опухолевым маркером для рака уротелия 4. Способ выявления злокачественного заболевания у субъекта, включающий контактирование биологического образца, полученного от субъекта, по крайней мере, с одним антителом в условиях и в течение промежутка времени, достаточного для обнаружения связывания указанного антитела с указанной антигенной детерминантой с иммунологическим связыванием одним антителом, выбранным из группы, возможен только в определенных условиях. Способ иммунологического обнаружения природных антител, узнающих белок, экстрагируемый из органов млекопитающих, узнаваемый моноклональными антителами, секретируемыми гибридомами, и присутствующий приблизительно в 93 твердых опухолей человека, за 2 11949 1 2009.06.30 ключающийся в обнаружении иммунного комплекса между указанными природными антителами и необязательно мечеными указанными белками, требует первоначального получения специфических природных антител путем иммунизации людей или животных 5. Способ выявления лимфатических узлов, включающими в себя опухольспецифичные лимфоциты 4, характеризующийся (а) введением больному эффективного количества радиоактивно-меченного локализатора, который специфически связывается с маркером,продуцируемым или ассоциированным с новообразованной тканью, (б) прохождением промежутка времени после завершения стадии (а), в течение которого указанный локализатор преимущественно сконцентрируется в какой-либо новообразованной ткани, а несвязанный радиоактивно-меченный локализатор будет выведен с тем, чтобы повысить уровень фотонной эмиссии из новообразованной ткани по сравнению с фоновой фотонной эмиссией указанного больного, (в) по истечении указанного промежутка времени на этапе(б) обследуют указанного больного чувствительным к радиации зондом для выявления лимфатических узлов, проявляющих накопление указанного радиоактивно-меченного локализатора, путем выявления с помощью указанного зонда повышенного уровня радиации в области указанных лимфатических узлов, (г) удаляют лимфатические узлы, выявленные на этапе (в), (д) отбирают такие удаленные лимфатические узлы, которые визуально не имеют признаков наличия опухоли, и (е) культивируют указанные лимфатические узлы,отобранные на этапе (д), с получением пролиферации в них опухольспецифичных лимфоцитов. Этот способ достаточно трудоемкий и к тому же для него необходимы радиоактивные элементы. Человеческое -антитело, генерируемое путем клонирования в систему экспрессии иммуноглобулина композиции антиген-связывающего домена человека, вызывает или опосредует убивание опухолевых клеток таким образом, что для упомянутого убивания не требуются ни цитотоксические формы, ни иммунологические механизмы. Способ достаточно эффективный, но требует проведения клонирования. Способ введения экзогенного гена в первичные лимфоидные клетки без подбора препаратов предусматривает следующие этапы 1) стимуляция выбранной лимфоидной субпопуляции факторами роста, которая вызывает пролиферацию лимфоидной субпопуляции 2) сокультивирование стимулированной лимфоидной субпопуляции с вируспродуцирующей хелперной клеточной линией, несущей ретровирусный вектор. При эффективном переносе гена в периферические лимфоциты устраняется необходимость в подборе препаратов 6. Достаточно эффективный метод для терапии, но требует трудовых затрат. Все вышеуказанные способы либо достаточно трудоемки (требуют наличия специальных условий, проведения клонирования, наличия радиоактивных элементов, предварительной иммунизации людей и т.п.), либо более успешно используются для лечения, для мониторинга за состоянием онкологических больных и оценки результатов лечения, чем для первичного диагноза злокачественной опухоли или рецидива, и, соответственно, не всегда дают достаточных возможностей для использования именно лимфоидных клеток в диагностике опухолей. Пример Предлагаемый способ диагностики рака осуществляется следующим образом 1. Получают лимфоидные клетки от опухоленосителей, содержащие набор антител,соответствующий специфическому для опухоли набору антигенов, контрольный набор антител от интактных (здоровых) индивидов, а также сыворотки опухоленосителей и интактных животных. В качестве моделей опухолевого роста используют мышей линии(2-3-месячного возраста) и асцитную карциному Эрлиха (АКЭ). Мышам прививают под кожу спины по 6106 клеток АКЭ. Через 24 дня после прививки получают сыворотку от каждой мыши в отдельности. У каждой мыши-опухоленосителя получают селезенку. Аналогичные операции проводят также с интактными мышами (контроль). Из селезенок получают суспензии лимфоидных клеток, в суспензии определяют по стандартной методике общее количество ядросодержащих лимфоидных клеток и, исходя из этого, количе 3 11949 1 2009.06.30 ство ядросодержащих клеток на селезенку опухоленосителей и интактных мышей, далее клетки подвергают трипсинизации. 2. Для исследования наличия противоопухолевых антител в лимфоидных клетках селезенок опухоленосителей и интактных мышей используют два способа- предварительный лизис лимфоидных клеток для удаления клеточных оболочек- экстракт из растертых кварцевым песком лимфоидных клеток. Лизис проводят с помощью дистиллированной воды. Дистиллированную воду при получении лизата (способ ) (или физиологический раствор при получении экстракта - способ ) добавляют к трипсинизированному осадку лимфоидных клеток опухоленосителя в соотношении 13. Надосадочную жидкость, полученную как с помощью лизиса, так и экстракции, используют в качестве противоопухолевых антител для выявления специфического для опухоли комплекса антигенов в сыворотке крови опухоленосителя. 3. Определение наличия опухолевого роста у мышей-опухоленосителей. Необходимые серии исследования 1) 0,1 мл СО 0,1 мл лизата лимфоидных клеток опухоленосителя 2) 0,1 мл СИнт 0,1 мл лизата лимфоидных клеток интактных мышей 3) 0,1 мл СО 0,1 мл экстракта лимфоидных клеток опухоленосителя 4) 0,1 мл СИнт 0,1 мл экстракта лимфоидных клеток интактных мышей. С помощью 3,5 ПЭГ 6000 определяют количество вновь образующегося ПЭГпреципитата (ИК) по сравнению с исходным уровнем ИК в сыворотке опухоленосителей или интактных мышей. Одновременно определяют количество ПЭГ-преципитата, образующегося при добавлении 3,5 ПЭГ-6000 к лизату или экстракту лимфоидных клеток опухоленосителей или интактных мышей. Из суммарного ПЭГ-преципитата, образующегося при взаимодействии сывороток опухоленосителей и интактных мышей с лизатами и экстрактами лимфоидных клеток опухоленосителей или интактных мышей и надосадочной инкубационной жидкостью, вычитали количество ИК, образовавшегося в СО или СИнт, и соответствующие величины лизатов и экстрактов. Лимфоидные клетки от отдельных мышей, соединенные в лизатах и экстрактах, содержащие противоопухолевые антитела, характеризующиеся специфической антионкотолерогенной активностью, используем в качестве комплекса тест-антител. При взаимодействии (реакции) антигенов сыворотки опухоленосителей с антителами лимфоидных клеток при добавлении ПЭГ 6000 количество образующегося преципитата обычно превышает исходный уровень ПЭГ-преципитата в этой сыворотке (при анализе из суммарной величины ПЭГ-преципитата, образующегося при реакции, вычитаем величину ПЭГ-преципитата контроля). Результаты исследований приведены в таблице. 1) Количество преципитата, образованного при проведении реакции сыворотки опухоленосителей АКЭ с лизатом лимфоидных клеток селезенки мышей-носителей АКЭ,достоверно на 80 превышало количество преципитата, образованного при проведении реакции сыворотки интактных мышей с лизатом лимфоидных клеток селезенки мышейносителей АКЭ (0,0630,0108 и 0,0350,0052 соответственно). 2) Количество преципитата, образованного при проведении реакции сыворотки опухоленосителей АКЭ с экстрактом лимфоидных клеток селезенки мышей-носителей АКЭ,достоверно на 92 превышало количество преципитата, образованного при проведении реакции сыворотки интактных мышей с экстрактом лимфоидных клеток селезенки мышей-носителей АКЭ (0,0460,0033 и 0,0240,0047 соответственно). Вывод превышение количества иммунных комплексов в сериях с комплексом тестантител над количеством иммунных комплексов в контроле свидетельствует о наличии опухолевого роста. При снятии онкотолерантности в результате прекращения контакта с онкотолерогеном при лизисе или экстракции лимфоидных клеток опухоленосителя были получены проти 4 11949 1 2009.06.30 воопухолевые антитела, с помощью которых были проведены реакции с сыворотками опухоленосителя, и количество иммунных комплексов, образовавшихся в опыте, достоверно отличалось от количества иммунных комплексов, образовавшихся в контрольной реакции лизата или экстракта, полученного от интактных мышей, с интактной сывороткой. Полученный результат свидетельствует о том, что в организме развивается антионкотолерогенная иммунологическая реакция, специфически направленная против онкотолерогена, который индуцировал толерантность. В результате отсутствия онкотолерогена лимфоидные клетки опухоленосителя выходят из состояния онкотолерантности, что выражается в продукции антионкотолерогенных противоопухолевых антител и развитии противоопухолевого иммунитета. При этом антитела специфичны, они осуществляют наиболее сильную иммунологическую реакцию с гомологичным им онкотолерогеном, которая превышает реакцию при взаимодействии этих антител с интактными сыворотками. Это свидетельствует о том, что антитела, полученные против ОТ, могут быть использованы для осуществления специфической, основанной на патогенезе рака его иммунодиагностике-выявлении при наличии опухоли (опухолевого роста) его признака - онкотолерогена в сыворотках и тканевых жидкостях опухоленосителей. Возможность использовать в клинических условиях противоопухолевые тестантитела, полученные либо у больных после полного хирургического удаления растущей опухоли, либо при ее наличии для обнаружения рецидива, или даже для первичного определения в диагностических целях, не является трудоемким процессом и не представляет никакой опасности. Доказана возможность с помощью лимфоидных клеток на любом этапе роста опухоли установить присутствие в сыворотке опухоленосителя специфического для данной опухоли комплекса свободных опухолевых антигенов и тем самым установить наличие (или отсутствие) опухолевого роста на любом его этапе. Таким образом, достигаемый технический результат заявляемого способа заключается в усилении специфичности, доступности и снижении материальных затрат при его применении. Определение количества ИК, образовавшихся в реакциях сывороток опухоленосителей АКЭ с лизатами и экстрактами лимфоидных клеток опухоленосителя Количество ИК КоличеПревышение(ед.опт.пл., Серии опыта ство опыта над Р 280 нм) (за вычепроб контролем,том всех контролей) СОлизат лимфоидных 1 7 0,0630,0108 80(1-2)0,05 клеток опухоленосителя СИнтлизат лимфоидных 2 7 0,0350,0052(3-4)0,05 клеток интактных мышей СОэкстракт лимфоид 3 ных клеток опухоленоси 7 0,0460,0033 92(1-4)0,05 теля СИнтэкстракт лимфо 4 идных клеток интактных 7 0,0240,0047(2-3)0,05 мышей Примечание. Контроли количество ИК СО 0,0180,008 количество ИК СИнт 0,0120,009 количество ИК лизата опухоленосителей 0,0050,0018 5 11949 1 2009.06.30 количество ИК лизата интактных мышей 0,0120,001 количество ИК экстракта опухоленосителей 0,0450,0005 количество ИК экстракта интактных мышей 0,0890,01. Источники информации 1. Красковский Г.В., Миголеня Т.И. Способ диагностики опухолевого роста и определения типа опухоли / Государственный Патентный комитет Республики Беларусь // Официальный бюллетень. - Мн. - 1998. -4 (19). - С. 177 (прототип). 2. Красковский Г.В. // В сб. Проблемы генетики. - Мн., 1994. - С. 151-170. 3. Коростелв С.А. Актуальные вопросы клинической онкологии. Противоопухолевые вакцины // Современная онкология. - Москва, 2003. - Т. 05. -4/2003. 4..,,,.-.//. - 1999. - . 19(4). - . 2591-2597. 5. Барторелли А. Антитела против аллогенных и ксеногенных белков, их применение в диагностике и терапии и способы их определения. Патент 2160445. - 10.12.2000. 6. Патент 5667998. - 1997. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6