Способ закрытия тканевых дефектов

(51) А 611 27/60, 27/38 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИ СОБСТВЕННОСТИ(54) СПОСОБ ЗАКРЫТИЯ ТКАНЕВЫХ ДЕФЕКТОВ(71) Заявитель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет (ВУ)(72) Авторы Тимощенко Павел Андрее(73) Патентообладатель Учреждение обра зования Белорусский государственный медицинский университет (ВУ)(56) Саркисов Д.С. и др. Хирургия. - 1993. Не 3. - С. 22-27. Саркисов Д.С. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и Медицины, 1995. - Т.СХ 1 Х. - Не 6. - С. 566-570. КН 2142820 С 1, 1999. КН 2010028 С 1, 1994. КН 2020898 С 1, 1994. 511 1650141 А 1, 1991.вич Доценко Эдуард Анатольевич Затолока Дмитрий Александрович Затолока Александр Степанович Чиркин Александр Александрович Путилина Тамара Алексеевна Мартов Юрий Борисович Подолинский Сергей Григорьевич Батов Виктор Васильевич (ВУ)Способ закрытия тканевых дефектов путем применения трансплантатов, включающих культуру аллогенных фибробластов, отличающийся тем, что на раневую поверхность дефекта накладывают трансплантат, представляющий собой амниотическую оболочку с культивированными на ней фибробластами, причем культуральным слоем к раневой поверхности, а приготовление трансплантата осуществляют путем выращивания 111 что культуры фибробластов в течение 28-35 дней, последующего нанесения культуры на амниотическую оболочку и совместного их культивирования в течение 7 дней.Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии и трансплантологии, и может быть использовано для улучщения результатов лечения больных с общирными дефектами тканей (посттравматического, послеоперационного, трофического и т.д. характера).Важной проблемой современной хирургии является повыщение регенерационной способности тканей с целью ускорения заживления ран, имеющих различную природу. К числу таких технологий относят применение физических факторов (лазерное излучение,воздействие ультразвуком и др.), фармакологическое лечение (мазевые аппликации, введение биогенных стимуляторов) и др. В последние годы щирокое распространение получают методологии использования различного рода трансплантатов, которые обеспечивают как механическую защиту раны, так и стимуляцию регенераторных свойств тканей. К ним относят трансплантаты аутогенных и аллогенных фибробластов на синтетической подложке, амниона человека, фибринных пленок, аутогенных кератиноцитов и др.Известен способ трансплантации аутогенных кератиноцитов путем закрытия длительно не заживающих ран, раневых дефектов пластами ткани различного размера (ау ВУ 8834 С 1 2006.12.30токератиноцитами), выращенными в условиях ш ушо из фрагментов ткани того же больного 1.Основные недостатки, препятствующие внедрению метода в широкую клиническую практику, следующиеиспользование аутогенных кератиноцитов приводит К низкому выходу культивируемых клетокдлительный срок получения необходимого размера аутотрансплантата (3-4 недели),что увеличивает риск развития осложнений у пациентаневозможность создания банков культурметодологическая сложность выращивания специализированной ткани - кератиноцитов.Известен способ закрытия тканевых дефектов с применением амниотической оболочки плода человека 2.жесткие условия консервации (О,25 раствор бриллиантовой зелени в 7 О этиловом спирте), что приводит к потере биологических свойств амнионаамнион как трансплантат выполняет только механические функции (структурные, защитные) - биологическая повязкаотсутствие бактериологического и вирусологического контроля может приводить к ухудшению приживления трансплантата, а также повышает риск заражения больного (например, гепатитом, ВИЧ-инфицирования и др.).Наиболее близким решением, выбранным в качестве прототипа, является способ закрытия тканевых дефектов с использованием аллогенных фибробластов, культивируемых на синтетической подложке 3.использование синтетической подложки для культивирования фибробластов. Наличие инородного (синтетического) образования в области раны может приводить к развитию асептического воспаления и ухудшению приживаемости трансплантатасинтетическая подложка (например, полупроницаемая мембрана Биофоль, Биокол 1 К) в силу уникального строения обладает высокой стоимостьюсинтетический материал не является продуцентом биологически активных веществ,что снижает эффективность проведения трансплантации.Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в улучшении свойств трансплантата.Поставленная задача решается предлагаемым способом закрытия тканевых дефектов путем использования трансплантатов из культуры аллогенных фибробластов, выращенной в условиях 111 что в течение 28-35 дней, в котором в качестве подложки для культивирования используют амниотическую оболочку плода человека и проводят совместное культивирование в течение 7 дней с последующим клиническим применением комплекса амниотическая оболочка человека - аллогенные фибробласты.Способ осуществляется в четыре этапа следующим образом.1 этап. Проводят подготовку амниотической оболочки плода человека.П этап. Готовят культуру фибробластов эмбриона человека.1 П этап. Наносят культуру фибробластов на амниотическую оболочку плода человека.П/ этап. Проводят курс имплантации аллогенных фибробластов на амниотической оболочке для закрытия тканевых дефектов.Способ выполняется следующим образом.Амнион после родов помещают в стерильный флакон с раствором Хенкса, содержащим 1 О-кратное количество антибиотиков (25 мг/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина). После доставки в лабораторию амнион подвергают 5-кратному промыванию встерильных чашках Петри И производят удаление из амниона остатков плацентарной ткани, кровяных сгустков и участков с повышенным количеством жировой и соединительной ткани. Последнее промывание амниона проводят в растворе Хенкса, не содержащем антибиотики, после чего амниотическую ткань помешают в питательную среду состава 5 гемогидролизат с 10 сыворотки КРС и антибиотиками (2,5 млн. пенициллина и 1 мкг/мл стрептомицина) промывные воды и среду культивирования проверяют на бактериальную загрязненность. Амниотическую оболочку исследуют гистологически.П этап. Приготовление культуры фибробластов эмбриона человека.Эмбриональную ткань, полученную после искусственного прерывания беременности(не по медицинским показаниям) в сроках 12-18 недель путем выскабливания, собирают в стерильный флакон с раствором Хенкса и 10-кратным количеством антибиотиков (пенициллина и стрептомицина). Эмбриональную ткань подвергают 5-кратному промыванию в растворах Хенкса с 10-кратным содержанием антибиотиков с удалением из эмбриональной ткани головных участков эмбриона и внутренних органов. Ткань эмбриона измельчают ножницами до размера 2-3 мм и переносят в колбу с 0,25 раствором трипсина,нагретым до 37 С, где в течение 30-40 мин эмбриональная ткань перемешивается до получения гомогенной массы, которую фильтруют через 3-слойную стерильную марлю. Профильтрованную суспензионную жидкость центрифугируют при 2-3 тыс. об./мин 40 мин. Полученный осадок ресуспензируют в следующей среде среда Игла (ДМЕМ) с содержанием 20 эмбриональной сыворотки телят с антибиотиками нормальной концентрации, и вносят в матрасы объемом 50 мл (1 млн. клеток/мл). На 3 сутки производят смену 50 культуральной среды с проверкой на стерильность.На 7 сутки культивирования, после формирования монослоя фибробластов, последние обрабатывают 0,25 раствором трипсина в течение 1 минуты при 37 С после 30-минутной инкубации клетки смывают средой Игла с 20 количеством КРС и производят посев на матрасы большего объема (1500 мл).Для исключения инфицированности донорского материала сыворотку женщин-доноров обследуют в соответствии с нормативами при заборе трупных трансплантатов на1) маркеры инфицированности гепатитами В, С и ДКультуральный материал, передаваемый на посадку, обследуют на загрязненность бактериальными организмами и грибами, для чего проводят посев культуральной жидкости наКроме того, проводят обследование на присутствие микоплазмы.1 П этап. Нанесение культуры фибробластов на амниотическую оболочку.В стерильные пенициллиновые флаконы вносят 4 мл питательной среды для культуры фибробластов и фрагмент амниона (обычно 2-5 см в диаметре). Затем во флаконы с питательной средой и амниотической оболочкой вносят 2-3 мл смывной культуральной жидкости, получаемой при очередном пассировании (4-5 пассаж) культуры фибробластов с содержанием фибробластов в последней от 800-1500 клеток/мл. Флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками и помешают в термостат до использования для подсадок на 7-10 сутки.Во всех случаях при пассировании культур клеток среды культивирования подвергаются бактериологическому контролю на стерильность. При гистологическом исследовании имплантируемой ткани амниона с нанесенной культурой фибробластов отмечается активная пролиферация фибробластов, пассируемых на поверхности амниона вне зависимости от стороны амниотической оболочки (материнской или хориональной).1/ этап. Проведение курса имплантации аллогенных фибробластов на амниотической оболочке.Трансплантацию комплекса амниотическая оболочка - аллогеннь 1 е фибробласть 1 осуществляют на гранулирующую поверхность либо свежую послеоперационную рану. В качестве примера приводим технологию применения трансплантата в оториноларингологической клинике для лечения полипозного риносинусита.После соответствующей аппликационной и инфильтрационной анестезии удаляют полипознь 1 е образования из среднего носового хода. При этом, как правило, не сохраняют всю слизистую оболочку латеральной стенки оперируемой области. Затем удаляют полипы, полипозно измененную слизистую, Костные перемычки из передних решетчатых клеток до основной пластинки средней носовой раковины. Состояние задних решетчатых клеток оценивают при эндоскопическом просмотре задних отделов верхнего носового хода и клиновидного кармана, а также через перфорацию основной пластинки средней носовой раковины. Далее с использованием оптики 3 О и зонда проводят ревизию носолобного канала, соустьев основной и верхнечелюстной пазух.После тщательного гемостаза на всю раневую поверхность накладывают амниотическую оболочку с культивируемыми аллогеннь 1 ми фибробластами таким образом, чтобы поверхность с фибробластами легла на раневую поверхность. Трансплантат расправляют и фиксируют пальцевидными резиновыми тампонами, заполненными поролоном. Нити от тампонов заплетают косичкой и пластырем прикрепляют к коже щеки.Тампоны удаляют на 2-3 сутки. В послеоперационном периоде проводят инструментальный туалет носа, носовой душ, применяют гормональные либо антибиотические мази,топические стероиды.При применении указанного трансплантата быстрее нормализовалось состояние раны - корок и фибринозного налета практически не было, быстрее уменьшался отек слизистой, восстанавливалось носовое дыхание. В поздние сроки наблюдения заживление проходило гладко, не было грубых рубцов, синехии отсутствовали. Сроки нахождения в стационаре у этих больных уменьшились на 3-4 дня.Таким образом, предложенный способ позволяет повысить эффективность лечения у больных с тканевыми дефектами.Его преимущества перед традиционным1) использование амниона в качестве подложки для культивирования фибробластов обеспечивает лучшие условия для роста последних в силу выделения амнионом биологически активных веществ - стимуляторов клеточного роста2) амнион является естественным низкоантигенным биологическим материалом, что обеспечивает лучшее приживление трансплантата3) амнион является источником биологически активных веществ, оказывающих позитивное влияние как на рост фибробластов, так и регенераторные свойства клеток раневой поверхности4) применение аллогенных фибробластов позволяет создать банк трансплантатов, что укорачивает сроки лечения больных.Больной Т., 38 лет, поступил в ЛОР отделение с жалобами на затрудненное дыхание через нос, слизистые выделения из носа, периодическую головную боль. Болен в течение 5 лет. При поступлении отмечалось при передней риноскопии отек слизистой носа, с двух сторон образования серо-розового цвета плотноэластической консистенции, некровоточащие. При задней риноскопии обнаружено образование (полипы) в общем носовом ходу серо-розового цвета.На основании клинических и рентгенологических данных поставлен диагноз Хронический полипозный синусит. Полипоз носа.Произведена операция - эндоскопическая полипополисинусотомия. Под местной анестезией 5 о 1.111 оса 1 п 1 10 и 5 о 1.1 То/оса 1 п 1 1 с использованием оптики О и 3 О удалены