Иммунокорригирующее средство

12 1/20 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Международный институт по радиоэкологии им. А.Д. Сахарова(72) Авторы Анисимова Наталия Ивановна Залашко Михаил Валентинович Борткевич Людмила Григорьевна(73) Патентообладатель Международный институт по радиоэкологии им. А.Д. Сахарова 5774 1 Изобретение относится к медицине, в частности к средствам терапии нарушений иммунитета, и может найти применение в клинической практике на территориях с радиоактивным загрязнением. Известны препараты на основе живых бактерий - компонентов нормофлоры, эффективные при лечении дисбактериозов, обладающие выраженным иммунопотенцирующим действием. Известен микроорганизм 2928, проявляющий в опытахмитогенную активность, а при длительном введении мышам оказывающий противоопухолевое действие 1. Терапевтическое действие культуры объясняется способностью к детоксикации потенциальных канцерогенов и стимуляции иммунитета. Задачей изобретения является изыскание микроорганизма, обладающего выраженным иммунокорригирующим действием не только, но и, в том числе в случае воздействия на макроорганизм острого ионизирующего излучения. Поставленная задача достигается тем, что в качестве иммунокорригирующего средства предложено использовать известный микроорганизм-10. Указанный микроорганизм ранее использовался для производства лечебно-профилактических кисломолочных продуктов и бактериальных препаратов для коррекции нормофлоры желудочно-кишечного тракта, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям. ШтаммКе-10 депонирован в коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии Академии наук Беларуси подБИМ-В 85 Д 2. В процессе исследований нами установлено, что культура бактерий штамма Ке-10 проявляет выраженный модулирующий эффект в отношении функции клеток иммунной системы, нарушенной в результате острого облучения. Под действием бактерий усиливается пролиферативный ответ лимфоцитов в культуре клеток цельной крови здоровых людей, т.е. они обладают прямым митогенным эффектом и могут оказывать стимулирующее воздействие на иммунокомпетентные клетки в физиологических пределах. Исследование иммунокорригирущих свойств бактерий штамма Ке-10 проведено на двух моделяхи. Пример 1. В моделиопределена дозозависимая способность данной культуры воздействовать на пролиферативную способность лимфоцитов периферической крови человека. Пролиферативный тест ставился в условиях культивирования клеток цельной крови, для чего использована культура клеток цельной крови 8 практически здоровых доноров, состоящих на учете в НИИ гематологии и переливания крови МЗ РБ. Кровь забиралась из кубитальной вены в асептических условиях и вносилась в соотношении 110 в полную культуральную среду 1640 , содержащую 10 инактивированной сыворотки плодов коров (ИЭМ МЗ РБ), 2 мМ глутамина , 25 ЕД/мл гепарина . Бактерии штамма Ке-10 добавляли в культуру цельной крови к моменту начала культивирования в концентрациях от 1 млрд. до 1 тыс. КОЕ/мл. В качестве положительного контроля пролиферативного ответа лимфоцитов использовали митоген Т-лимфоцитов человека - фитогемагглютининв концентрации 10 мкг/мл. Культивирование осуществляли в течение 96 ч при 37 С в увлажненной атмосфере с 5 углекислоты. Степень пролиферативного ответа оценивали по включению тимидина, меченного тритием, который вносили в культуру в дозе 7,4-104 Бк/мл за 18 ч до окончания культивирования. Активность распада трития учитывалась на сцинцилляционном -счетчике -1(США). Уровень стимуляции пролиферативного ответа выражали индексом стимуляции отношение распадов радиоактивного тимидина, включенного в стимулированную культуру цельной крови, к данному показателю в исходной культуре. 2 5774 1 Результаты изучения митогенной активности культуры штамма Ке-10 представлены на рис. , из которого видно, что под действием бактерий усиливается пролиферативный ответ в культуре клеток цельной крови здоровых людей. Индекс стимуляции пролиферативного ответа лимфоцитов носит дозозависимый характер и составляет от 0,90,04 до 5,60,35. Оптимальная митогенная доза бактерий - 10 млн. КОЕ/мл культуральной среды. Для сравнения представлена средняя величина индекса стимуляции пролиферативного ответа лимфоцитов в этой же среде, индуцированной фитогемагглютинином (ФГА) - 8,76. Эти данные свидетельствуют о том, что культура бактерий штамма Ке-10 обладает прямым митогенным эффектом и может оказывать стимулирующее воздействие на иммунокомпетентные клетки в физиологических пределах. Относительно невысокие индексы стимуляции,полученные нами в культуре клеток цельной крови, объясняются супрессирующим воздействием на пролиферативный ответ продуктов деградации эритроцитов. Пример 2. В экспериментеиспользовали 40 крыс линии - шестимесячного возраста. Выделено 4 группы крыс по 10 животных в каждой. Первую группу составили крысы,получавшие в качестве пищевой добавки среду культивирования бактерий штамма Ке-10 стерилизованное обезжиренное молоко (интактный контроль). Вторая группа крыс получала ту же добавку, что и первая, но животные этой группы были облучены на облучателе ИГУР-1 (мощность экспозиционной дозы -излучения - 5,4 рентгена/мин,время облучения 55,5 мин, доза облучения - 3,0 Зв), (контроль облучения). Крысы, отнесенные к третьей группе, в виде пищевой добавки получали культуру бактерий штамма Ке-10 в среде культивирования (контроль культуры бактерий). Четвертая опытная группа животных была подвергнута облучению в дозе 3,0 Зв при тех же параметрах лучевого воздействия, что и вторая группа, но, начиная с первого часа после окончания, в течение 15 суток (через сутки) получала в пищевом рационе культуру исследуемых бактерий. Ежедневная доза бактерий содержала 4109 КОЕ. Функционирование иммунной системы экспериментальных животных оценивалось через 30 суток после завершения опыта по следующим критериям способности к спонтанному и индуцированному конканавалином( А) пролиферативному ответу лимфоцитов в культуре цельной крови крыс, содержанию в супернатантах культур клеток цельной крови крыс интерлейкина-2(-2). Для исследования этих показателей у крыс забиралась интракардиальная кровь, которая культивировалась в условиях, обозначенных в примере 1, в течение 24 и 96 ч. В супернатантах 24-часового культивирования определяли активность -2 по методу ,основанному на использовании -2-зависимой культуры клеток лейкоза человека -2. Количество биологически активных молекул -2 в супернатантах рассчитывали по калибровочной кривой, полученной при титровании в тех же условиях стандартного рекомбинантного -2 (Латвия). Клетки крови крыс 96-часового культивирования исследовали в пролиферативном тесте с 3 Н тимидином, как в примере 1. В результате радиационного воздействия у экспериментальных животных сформировался дефект пролиферативного ответа, сущность которого состояла в активизации спонтанной пролиферации лимфоцитов и достоверным снижением ответа на митогенный стимул (табл. 1, группа 2). Культура бактерий штамма Ке-10 при поступлении в организм необлученных животных (группа 3) не оказывала существенного влияния на спонтанное размножение лимфоцитов периферической крови при их культивировании. Лимфоциты животных этой группы под воздействием пищевой добавки в виде культуры изучаемых бактерий приобретали способность более активно (р 0,05) отвечать на Т-клеточный митоген для лимфоцитов крыс -А. В опытной группе крыс (4 группа) выявлено восстановление до уровня нормальных значений как спонтанного, так и индуцированногоА пролиферативного ответа. Это означает, что пероральный прием культуры бактерий 3 5774 1 штамма Ке-10 способствует ликвидации радиационно-индуцированного иммунодефицитного состояния в условиях. При исследовании механизма этого явления мы исходили из хорошо освещенного в литературе факта, что важнейшим фактором пролиферации лимфоцитов в организме млекопитающего является -2, который синтезируется активированными Т-хелперными лимфоцитами 1 типа. В табл. 2 представлены данные изучения продукции -2 лимфоцитами облученных и необлученных животных и воздействия на этот процесс бактерий штамма Ке-10. Т-лимфоциты крыс, составивших группу интактный контроль, синтезируют указанный лимфокин только после активацииА. Иммуноциты облученных животных приобрели способность к спонтанной продукции -2 в достаточно высоких концентрациях. После индукции этих клеток митогеном уровень синтеза и секреции -2 превысил физиологическую норму. Эти данные соответствуют литературным, утверждающим активацию синтеза -2 клетками иммунной системы, подвергшимися воздействию ионизирующего излучения. Т-лимфоциты необлученных крыс, получавших культуру бактерий, несколько усиливали процесс синтеза -2 при активации митогеном. В опытной группе животных обнаружена реабилитация процесса синтеза -2 - одного из важнейших иммунорегуляторных цитокинов. Таким образом установлено, что культура бактерий штамма Ке-10 не только обладает выраженной антимикробной активностью по отношению к ряду патогенных и условнопатогенных бактерий - возбудителей заболеваний ЖКТ, но проявляет также выраженный модулирующий эффект в отношении функции клеток иммунной системы, нарушенной в результате воздействия острого облучения. Результаты, полученные в модельных экспериментах, дают основание полагать, что культура бактерий штаммаКе-10 и препараты на ее основе могут быть использованы для лечения различных заболеваний, связанных с нарушением функции системы иммунитета. Таблица 1 Влияние культурыКе-10 на пролиферативный ответ лимфоцитов в культуре клеток периферической крови облученных и необлученных крыс Группа крыс 1 2 3 4 Условия эксперимента Интактный контроль Контроль облучения Контроль культуры лактобацилл Опыт Пролиферативный ответ индуцированныйспонтанный расп./мин 5774 1 Таблица 2 ВлияниеКе-10 на способность Т-лимфоцитов продуцировать интерлейкин-2 в культуре клеток цельной крови облученных и необлученных крыс Группа крыс 1 2 3 4 Условия эксперимента Интактный контроль Контроль облучения Контроль культуры лактобацилл Опыт(5). - . 327-333. 2. Положительное решение по заявке ВУ 1084 от 24.12.93 г. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.