Способ получения L-аспарагиновой кислоты

( 12 13/20, 12 119) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Закрытое акционерное общество Биоамид(72) Авторы Синолицкий Максим КонстантиновичАтрахимович Наталья ИвановнаВоронин Сергей Петрович Герасимова Татьяна Васильевна Дебабов Владимир Георгиевич Клыгина Ольга Юрьевна Козулин Сергей Владимирович Ларикова Галина Андреевна Леонова Татьяна Евгеньевна Полунина Евгения ЕвгеньевнаПетров Петр Тимофеевич Синтин Андрей Анатольевич Синолицкая Стэлла Владимировна Трухачева Татьяна Викторовна Царенков Валерий МиновичЯненко Александр Степанович(73) Патентообладатель Закрытое акционерное общество Биоамид(57) 1. Способ получения -аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе клетокс последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в процессе биотрансформации используют биокатализатар на основе штаммаВКПМ В-7188, выращенного на питательной среде, содержащей уксусную кислоту. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют биомассу клеток . ВКПМ В-7188 в нативном или иммобилизованном виде. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют биомассу клеток . ВКПМ В-7188, выращенную на среде, содержащей 0,0001-5,0 мас.уксусной кислоты. 5345 1 Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения -аспарагиновой кислоты, применяемой в медицине, пищевой и микробиологической промышленности. Известны способы получения -аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью микроорганизмов рода(заявка ЕР 0111293, 1984),рода(заявка ЕР 0110422, 1984), рода , ,и др.(заявка ЕР 0752476, 1997). Однако все эти способы являются многостадийными, достаточно трудоемкими, требуют специальных питательных сред для используемых штаммов. Известен способ получения -аспарагиновой кислоты с использованием штамма 85 (а.с. СССР 644833). Способ является недостаточно эффективным из-за невысокой аспартазной активности используемого штамма. Наиболее близким к заявленному способу является способ получения -аспарагиновой кислоты, предусматривающий обработку раствора фумарата аммония биокатализатором,на основе клетокс последующим выделением -аспарагиновой кислоты(авт. св-во СССР 659611, С 12 Р 13/20, 1979). В качестве биокатализатора в данном способе используют клетки одного из штаммов 83 или АН 52, или 85, иммобилизованные включением в полиакриламидный гель. Процесс биотрансформации ведут, как правило, пропуская раствор фумарата аммония через колонку, заполненную частицами полиакриламидного геля с включенными в него клетками Е. . Недостатками способа являются невысокая эффективность процесса культивирования клеток Е. , получения биокатализатора и, как следствие, низкая эффективность всего процесса получения -аспарагиновой кислоты. Это связано с тем, что используемые в способе штаммы Е.требуют для своего выращивания многокомпонентных сред, стоимость которых достаточно высока. Кроме того,к недостаткам штаммовможно отнести следующее аспартазная активность штамма достигает максимальных значений на ранних логарифмических стадиях роста (6-10 ч), когда урожай клеток низкий. На стационарной фазе роста, когда достигается максимальный урожай клеток, аспартазная активность быстро снижается. В присутствии в питательной среде глюкозы как источника углерода аспартазная активность бактерий снижается и, как результат этого, снижается эффективность процесса получения аспарагиновой кислоты. По этой причине при культивировании клеток .приходится использовать большие объемы или осуществлять многократное воспроизведение клеток штамма-биотрансформатора. Все вышеперечисленные факторы удорожают процесс и делают его неэффективным с точки зрения промышленного воспроизводства. Настоящее изобретение направлено на повышение эффективности процесса получения -аспарагиновой кислоты за счет снижения трудоемкости и удешевления процесса,связанного с применением более эффективного биокатализатора на основе нового штамма.и особенностей культивирования штамма. Технический результат заявленного способа заключается, в частности, в обеспечении более высокой аспартазной активности биокатализатора на основе клеток штамма Е.858 (ВКПМ В-7188). Таким образом, предлагаемый способ получения -аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе микробных клетокс последующим выделением целевого продукта предусматривает использование в процессе биотрансформации биокатализатора на основе штамма Е.ВКПМ В-7188, выращенного на питательной среде, содержащей уксусную кислоту. В качестве биокатализатора в предлагаемом способе может быть использована биомасса клеток штамма Е.ВКПМ В-7188 как в нативном, так и в иммобилизованном виде. При этом может быть использована биомасса клеток штамма ВКПМ В-7188, выращенного на среде с содержанием уксусной кислоты 0,0001 до 5 . 2 5345 1 Способ осуществляют следующим образом. Характеристика используемого штамма .858 (ВКПМ В-7188). Среди клонов Е.85, образующих колонии на среде М 9 с альфа-метил-Д-глюкопиранозидом, 50 мМ (аналогом глюкозы) были выделены мутанты с высокой аспартазной активностью. Выделенные штаммы выращивали при 37 в колбах с перемешиванием. Среда для культивирования - М 9 с добавлением аммония хлорида - 3 г/л, глюкозы - 10 г/л,кукурузного экстракта -5 г/л. В табл. 1 представлены сравнительные данные по активности для родительского и выделенных мутантных штаммов. Таблица 1 Параметры Исходный штамм 85 Фаза роста ЛФ СФ Удельная аспартазная активность Ед.акт./ед ОП 21,8 1,8 Общая аспартазная активность Ед.акт./мл К.Ж. 104,6 12,4 ЛФ - логарифмическая фаза роста, время культивирования 6 час. СФ - стационарная фаза роста, время выращивания 21 ч. Используемый в способе штамм Е.858 (ВКПМ В-7188) показал повышение аспартазной активности при включении в питательную среду уксусной кислоты (или ее солей). Причем это повышение активности наблюдалось как для культур в логарифмической, так и в стационарной фазе. Способ получения стационарных культур с высокой аспартазной активностью и урожаем клеток осуществляли культивированием клетокна среде следующего состава 24 12 Н 2 О - 1,5 г/л КН 2 РО 4 - 0,75 г/л- 0,5 г/л СаС 12 - 0,01 г/л фумарат натрия - 3 г/л ацетат аммония - 5 г/л кукурузный экстракт - 5 г/л. В этих условиях штамм Е.858 обладает высокой аспартазной активностью, которая достигает максимума на стационарной фазе роста (21 ч). Результаты культивирования используемого и исходного штаммов в колбах представлены в табл. 2. Таблица 2 Параметры Исходный штамм 85 Фаза роста ЛФ СФ Удельная аспартазная активность Ед.акт./ед ОП 85,7 95,4 Общая аспартазная активность Ед.акт./мл К.Ж. 120,0 410,2 Таким образом, использование уксусной кислоты вместо глюкозы в качестве источника углерода для выращивания клеток Е.858 позволяет решить две важные проблемы повысить аспартазную активность клеток и обеспечить достижение максимального уровня активности на стационарной фазе, когда клеточный урожай достигает максимальных значений. Вводимое в питательную среду количество уксусной кислоты (от 0,0001 до 5 ) является оптимальным. Повышение концентрации свыше 5 не приводит к повышению урожайности клеток. Ниже приводятся примеры по получению клеток Е.858 (ВКПМ В-7188), являющегося биокатализатором процесса получения -аспарагиновой кислоты, и примеры получения -аспарагиновой кислоты с его использованием. 3 5345 1 Аспартазную активность определяли следующим образом к 4 мл 1 М раствора фумарата аммония прибавляли 1 мл суспензии предварительно активированных микробных клеток и инкубировали смесь при перемешивании один час при 37 . Количество образовавшейся аспарагиновой кислоты определяли методом ВЭЖХ. За единицу активности принято образование одного микромоля аспарагиновой кислоты за один час. Оптическую плотность клеточной суспензии определяли при длине волны 540 нм и оптическом пути 5 мм. Активирование микробных клеток перед получением -аспарагиновой кислоты проводили инкубированием суспензии клеток в 1 М растворе фумара аммония при 37 С в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для ионов фумарата и аспартата. Пример 1. Культивирование микроорганизмов. Односуточную культуру 858 (ВКПМ-В-7188) смывают с поверхности МПА 1-2 мл физиологического раствора и стерильно переносят в колбу Эрленмеера на 250 мл с жидкой питательной средой в объеме 50 мл следующего состава 24 12 Н 2 О 1,5 г/л, КН 2 РО 4 - 0,75 г/л,- 0,5 г/л, СаС 12 - 0,01 г/л, фумарат натрия - 3 г/л, ацетат аммония - 5 г/л, кукурузный экстракт - 5 г/л, рН 7,0. Культивирование ведут при 28-30 на круговом встряхивателе в течение 16-20 ч. Посевной материал переносят в 3-литровый ферментер, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Условия культивирования температура 29 , аэрация - 2 л/мин, перемешивание - 500 об/мин, рН 7,9. Система автоматического поддержания рН осуществляет дозировку питательного раствора уксусной кислоты (70 г). Время культивирования 22-26 ч. Оптическая плотность К.Ж. на сливе 20 ед. (540 нм). Удельная аспартазная активность -148,0 Ед.акт./ОП. Общая аспартазная активность - 2960 Ед.акт./мл. Клетки отделяли центрифугированием и промывали физиологическим раствором. Количество собранных влажных клеток в виде пасты составило 104 г. Пример 2. Получение аспарагиновой кислоты нативными клетками. 0,8 г пасты клеток, полученной в примере 1, разводят в 19 мл 1 М раствора фумарата аммония. Полученная суспензия имеет оптическую плотность 15 ед. (540 нм). Данную суспензию помещают в термостат на 37 С на 17 ч. В реактор с рубашкой и мешалкой объемом 250 мл помещают 180 мл раствора фумарата аммония. В рубашку реактора непрерывно подают воду с температурой 37 С. При перемешивании добавляют суспензию активированных клеток. Реакцию биотрансформации ведут в течение 6 ч. Затем полученный раствор центрифугируют, отделяя микробные клетки, и к надосадочной жидкости, при перемешивании, добавляют 30 -ный раствор серной кислоты до достижения рН в растворе 2,9 ед. При этом выпадает обильный осадок аспарагиновой кислоты. Полученную суспензию охлаждают до 10 С, выдерживают 1 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 200 мл захоложенной воды и сушат при температуре 50 С до постоянного веса. Количество полученного продукта 21,4 г. Пример 3. Получение -аспарагиновой кислоты с помощью иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток Е.858. Биомассу клеток штамма Е.858 из примера 1 в количестве 15 г суспензируют в 27,3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20 , рН 7,5. Смесь охлаждают до 5 С и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6,15 г акриламида, 0,36 г ,-метиленбис-акриламида, 1,0 г 5 -ного водного раствора -тетраметилэтилендиамина и 0,2 свежеприготовленного 5 -ного водного раствора персульфата аммония. 5345 1 Полученный гель измельчают, промывают сначала водой, потом 1,5 М раствором фумарата аммония. Гранулами геля заполняют термостатируемую при 30 колонку и пропускают через нее 1,5 М раствор фумарата аммония, содержащий 0,0001 48,5. Выделение -аспарагиновой кислоты проводят как в примере 2. Из 1000 мл элюата получают 184 г кристаллической -аспарагиновой кислоты. Удельный угол вращения в 5 н НС 2024,9. Как показали эксперименты, предлагаемый способ обеспечивает более эффективное получение -аспарагиновой кислоты за счет удешевления и упрощения процесса, достижения максимальной аспартазной активности используемого штамма .858 и урожайности культуры. Исключается необходимость использования дорогостоящих питательных сред и больших объемов культивирования. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.