Способ определения содержания флуоресцирующего пигмента, в частности протохлорофиллида, в ткани растительного объекта по спектральным параметрам

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО ПИГМЕНТА, В ЧАСТНОСТИ ПРОТОХЛОРОФИЛЛИДА, В ТКАНИ РАСТИТЕЛЬНОГО ОБЪЕКТА ПО СПЕКТРАЛЬНЫМ ПАРАМЕТРАМ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Савченко Галина Евсеевна Кабашникова Людмила Федоровна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(56) ДОМАНСКАЯ И.Н. // Известия Национальной академии наук Беларуси,ерия биологических наук. - 2000.4. - С. 42-45.1450788 А 1, 1989.1423991 , 1976.2001264254 А, 2001. ГАВРИЛЕНКО В.Ф. и др. Большой практикум по фотосинтезу. - Москва,2003. - С. 70-96.(57) Способ определения содержания флуоресцирующего пигмента, в частности протохлорофиллида, в ткани растительного объекта по спектральным параметрам, заключающийся в том, что препарат из ткани растительного объекта закрепляют на держателе,выполненном в форме трубки с фиксированным шагом ее поворота, охлаждают в жидком азоте и регистрируют спектры флуоресценции в разных участках препарата затем осуществляют обработку без демонтажа препарата путем размораживания при комнатной температуре в течение не менее 30 мин и нагревания при 70-75 С в течение 3-7 мин в суховоздушной камере вновь охлаждают препарат в жидком азоте и регистрируют низкотемпературные спектры флуоресценции в тех же участках препарата, где зарегистрированы спектры флуоресценции до нагревания, и определяют в них содержание пигмента по величине интенсивности флуоресценции в области 633 нм. Изобретение относится к биологическим наукам, в частности к биофизике биохимии и физиологии растений, и может быть использовано в любых экспериментах, где необходимо произвести измерение параметров флуоресценции и содержания флуоресцирующего пигмента (в частности, протохлорофиллида (Пд), присутствующего в растительном объекте в небольшом количестве, но в виде молекулярных агрегатов. Известен способ определения содержания Пд после экстракции пигментов из тканей растений растворителями с последующим фотометрированием растворов 1. Однако этот способ длителен и требует большого количества растительного материала. Недостатком 12778 1 2010.02.28 его является то, что определенный таким способом Пд представляет собой весьма усредненную пробу, не учитывающую неравномерность распределения пигмента в листе или другом органе растения и не может отражать количественного содержания пигмента в минимально возможном участке листа. Способ не предусматривает определения спектральных свойств объекта. Известен способ обнаружения Пд-пигментов в растительных тканях с помощью измерения спектров флуоресценции нативных листьев при температуре жидкого азота 2, позволяющий тестировать очень низкое количество пигментов. Этот метод дает информацию о состоянии всех флуоресцирующих компонентов растительной клетки в нативном состоянии,но его трудно прямо применить для оценки их количества, поскольку измеряемая интенсивность свечения может не отражать их содержания. Это связано как с неравномерным распределением пигментов в мембранах пластид, так и с их агрегированным состоянием,при котором происходит тушение флуоресценции, которое объективно трудно оценить. В частности, в низкотемпературных спектрах флуоресценции этиолированных листьев в норме обнаруживаются как минимум две пространственно разделенные формы Пд длинноволновая с максимумом флуоресценции при температуре жидкого азота при 657 нм(Пд 633). Для того чтобы определить общее содержание любого флуоресцирующего пигмента в ткани листа, необходимо упразднить межмолекулярные взаимодействия внутри пигментных агрегатов, максимально приблизив состояние пигмента к наблюдаемому в растворах. При этом в случае Пд форма Пд 657 в спектре флуоресценции должна полностью превратиться в форму Пд 633, а интенсивность флуоресценции последней при этом должна достичь максимальной величины, пропорциональной концентрации Пд в анализируемом участке ткани листа. Известен способ, при котором растительный объект закрепляют на плоском металлическом держателе, замораживают, погружают держатель в криостат в строго фиксированном положении и регистрируют параметры флуоресценции объекта в жидком азоте, затем кипятят его несколько минут прямо на металлическом держателе, просушивают, вновь замораживают и регистрируют спектры флуоресценции такого жестко денатурированного образца с целью определения в нем содержания пигментов по интенсивности свечения всей полосы в области 615-660 нм 3. Недостатком этого способа является неизбежное растрескивание препарата при очень быстрой смене температур, осложнение контроля температуры денатурации объекта для получения воспроизводимых результатов и снижение интенсивности свечения полосы Пд при перегреве. При этом способе монтажа препарата практически невозможно многократное измерение спектров в разных участках одного и того же листа. Нами показано, что при кипячении образца, закрепленного на металлическом держателе, может появляться дополнительная полоса свечения Пд при 690 нм. На фиг. 1 приведены низкотемпературные спектры флуоресценции листьев этиолированных проростков ячменя (участков листа, находящихся на расстоянии 1 см от верхушки) до (1) и после (2) кипячения образца, закрепленного на металлическом держателе. Возбуждение 440 нм, -196 С. На осях ординат - величина интенсивности флуоресценции в относительных единицах. На оси абсцисс - длина волны, нм. Важность контроля температуры денатурации для определения содержания Пд в растительном объекте можно продемонстрировать следующим примером. На фиг. 2 представлена спектральная картина превращений разных форм Пд в одинаковых участках листа 8 дневных этиолированных проростков ячменя после 2 мин нагревания в воде 1 - 25 С,2 - 40 С, 3 - 45 С, 4 - 50 С, 5 - 60-75 С (возбуждение - 440 нм, регистрация при -196 С). Каждая кривая является результатом усреднения нескольких измерений (разные биологические повторности), стандартная ошибка которых может достигать 10 . Видно, что при нагревании происходит полное превращение длинноволновой формы пигмента Пд 657 в коротковолновую Пд 633, но изменение интенсивности флуоресценции Пд 633 носит нели 2 12778 1 2010.02.28 нейный характер интенсивность флуоресценции Пд 633 сначала падает, по-видимому, за счет тушения (кривая 3), и только после завершения этого процесса вновь увеличивается до максимума (кривая 5). Вполне вероятно, что температурный предел этого перехода может несколько отличаться у разных видов растений из-за различий в морфологии листа или другого органа растения. Известен способ денатурации с помощью детергентов, при котором в спектрах денатурированного образца присутствует только одна форма Пд 633 3. Способ включает разделение листа на 2 симметричных отрезка, обработку с помощью инфильтрации ткани одной половины листа раствором детергента (в контрольную половину инфильтрируют воду) для разрушения нативной структуры мембран и упразднения пигмент-пигментных взаимодействий монтаж обеих половинок на 2-х разных плоских металлических держателях, охлаждение их до температуры жидкого азота и измерение низкотемпературных спектров флуоресценции в двух параллельных пробах (с детергентом и без детергента). Однако введение в лист детергента с помощью инфильтрации требует не только затрат времени, но и демонтажа препарата при последовательном измерении флуоресцентных параметров либо параллельного измерения, что исключает возможность мониторинга флуоресцентных параметров ткани и содержания пигмента в одном и том же участке листа. Задачей изобретения является разработка быстрого и надежного способа измерения параметров флуоресценции как можно большего числа участков ткани растительного объекта без демонтажа препарата, повышение точности определения содержания флуоресцирующего пигмента, в частности протохлорофиллида, в ткани и возможность сопоставлять его содержание с другими флуоресцентными параметрами нативного объекта в одном и том же минимальном по размеру анализируемом участке. Поставленная задача решается предлагаемым способом определения содержания флуоресцирующего пигмента, в частности протохлорофиллида, в ткани растительного объекта по спектральным параметрам, для чего препарат из ткани растительного объекта закрепляют на держателе, выполненном в форме трубки, с фиксированным шагом ее поворота. Затем его охлаждают в жидком азоте и регистрируют спектры флуоресценции в разных участках препарата. После этого без демонтажа препарата осуществляют обработку,путем размораживания при комнатной температуре в течение не менее 30 мин и последующего нагревания при 70-75 С в течение 3-7 мин в суховоздушной камере. Затем препарат охлаждают в жидком азоте и регистрируют низкотемпературные спектры флуоресценции в тех же участках растительного препарата, где были зарегистрированы спектры флуоресценции до нагревания. Далее определяют в этих участках содержание пигмента по величине интенсивности флуоресценции в области 633 нм. Способ осуществляют следующим образом. Анализируемый растительный объект (например, лист) закрепляют липкой прозрачной лентой на конце трубки-держателя (из инертного нефлуоресцирующего материала) с фиксированным шагом вращения, опускают в криостат с жидким азотом и регистрируют спектры флуоресценции в разных участках листа, поворачивая держатель. Это дает информацию о состоянии пигментного аппарата исследуемого растительного объекта (и о взаимодействиях любых флуоресцирующих внутриклеточных соединений хлорофиллов, восстановленных нуклеотидов, белков). Затем держатель с образцом выдерживают некоторое время при комнатной температуре в темноте для предварительного оттаивания (не менее 30 мин) и переносят далее в воздушный термостат на 3-7 мин при 70-75 С для окончательного упразднения межмолекулярных взаимодействий. После этого держатель с образцом вновь опускают в криостат с жидким азотом и регистрируют низкотемпературные спектры флуоресценции растительного объекта с целью определения в них содержания Пд по величине интенсивности флуоресценции единственной полосы в области 633 нм в тех же участках растительного препарата, где были зарегистрированы флуоресцентные параметры до нагревания. Только в этом случае интенсивность свечения этой полосы пропорциональна содержанию пигмента в данном типе растительной ткани. 3 12778 1 2010.02.28 Использование заявляемого способа позволяет определять непосредственно в ткани объекта любые флуоресцирующие пигменты, присутствующие в очень незначительных количествах, но склонные к агрегации (не только протохлорофиллид, но и хлорофилл в зеленеющих тканях листа, лепестках, а также в поверхностном слое плодов и клубней), и таким образом оценивать биосинтетические способности минимальных по размеру участков растительных тканей и сравнивать их с другими процессами, происходящими в растительной клетке, которые отражаются на параметрах флуоресценции нативного объекта до нагревания. Изобретение может быть использовано для мониторинга спектральных свойств и локального содержания пигментов в ткани растительных объектов во всех современных флуориметрах. Примеры конкретного выполнения. Пример 1 На фиг. 3 представлены низкотемпературные спектры флуоресценции листьев этиолированных проростков ячменя (участков листа, находящихся на расстоянии 1 см от верхушки) до и после нагревания в суховоздушном термостате. 1 - листья до нагревания, 2 те же листья после регистрации низкотемпературных спектров, размороженные при комнатной температуре в течение 30 мин без демонтажа и инкубированные 5 мин в суховоздушном термостате при 75 С (возбуждение - 440 нм, регистрация при -196 С. На осях ординат - величина интенсивности флуоресценции в относительных единицах. На оси абсцисс - длина волны, нм). Сравнение данных, приведенных на фиг. 1 и 3, свидетельствует о явном преимуществе более мягкого способа температурной денатурации для мониторинга содержания пигментов (фиг. 3) по сравнению с жестким кипячением (фиг. 1) при нагревании в термостате интенсивность свечения при 633 нм выше, чем при кипячении образца (размерность правой ординаты на фиг. 1 и 3 - разная). Пример 2 На фиг. 4 показан один из вариантов измерения флуоресцентных параметров и содержания Пд, а именно результаты нескольких попарных измерений параметров флуоресценции (в данном случае - это две формы Пд, кривые 1) и содержания Пд (кривые 2) в разных участках листа, подвергнутого такой физиологической обработке, в результате которой изменилось соотношение форм Пд (иное, чем на фиг. 3, где преобладала форма Пд 657). 1 - низкотемпературные спектры флуоресценции до нагревания, 2 - после размораживания образца при комнатной температуре в течение 30 мин без демонтажа препарата и его нагревания в суховоздушном термостате в течение 5 мин при 75 С. Условия регистрации спектров аналогичны представленным на фиг. 1-3. Из приведенных данных видно, что до нагревания в разных участках образца содержится примерно одинаковое количество двух форм Пд при небольшом преобладании длинноволновой формы, а после нагревания во всех трех участках обнаруживается разное количество Пд (интенсивность свечения Пд 633 после нагревания хотя и выше, чем суммарная интенсивность форм Пд 633 и Пд 657 до нагревания, но неодинакова в разных участках анализируемого листа). Источники информации 1.,.// .. .. - 1958-1959. - . 58. - .331. 2. Литвин Ф.Ф., Красновский А.А. Исследование процесса образования хлорофилла и его состояния в листьях растений по спектрам флуоресценции // Известия АН СССР. Сер. физ. - 1959. - Т. 23. -1. - С. 82-85. 3. Доманская И.Н. Определение эффективности переноса энергии от протохлорофиллида к хлорофиллу в зеленых и зеленеющих листьях ячменя // Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус. Сер. бял. навук. - 2000. -4. - С. 42-45. 4 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5