Способ определения количества апоптотически измененных клеток в ткани

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА АПОПТОТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ КЛЕТОК В ТКАНИ(71) Заявитель Учреждение образования Гомельский государственный медицинский университет(72) Автор Туманов Эдуард Викторович(73) Патентообладатель Учреждение образования Гомельский государственный медицинский университет(57) Способ определения количества апоптотически измененных клеток в ткани, включающий гистохимическую обработку гистологических срезов изучаемой ткани, отличающийся тем, что взвешивают образец исследуемой ткани или измеряют его объем, выделяют клеточные ядра из образца, окрашивают полученную ядерную суспензию красителем, выявляющим концевые разрывы ДНК, после чего производят подсчет количества апоптотически измененных ядер, которое соответствует количеству апоптотически измененных клеток в изучаемом образце, и производят пересчет полученных данных на единицу массы или объема изучаемого образца.(56) Коршунов А.Г. и др. Архив патологии. - 1998. - Т. 60. -3. - С. 23-27. Цыпленкова В.Г. и др. Архив патологии. - 1998. - Т. 60. -6. - С. 13-18.. . .. - 1994. - . 42. - . 149-158. Никонова М.Ф. и др. Иммунология. - 1999. -2. - С. 20-23. Изобретение относится к медицине и может быть использовано в патологической анатомии, гистологии, иммунологии и в других областях клинической медицины, а также в практической и экспериментальной биологии. Известен способ определения количества апоптотически измененных клеток в ткани путем окрашивания изучаемого пула клеток специальными красителями с подсчетом количества клеток подвергшихся апоптозу, проточной цитофлюорометрией 1. Недостатком данного способа является то, что он применим только для исследования свободно расположенных клеток, например клеток крови. Наиболее близким к предлагаемому способу определения количества апоптотически измененных клеток в ткани является способ, согласно которому гистологические срезы исследуемой ткани подвергают специальной гистохимической обработке 2 3 - прототип. Недостатками прототипа являются относительно высокая стоимость трудоемкость 6551 1 недостаточная достоверность субъективность. Задача, на решение которой направлено предполагаемое изобретение, заключается в создании высоко достоверного и воспроизводимого способа определения количества апоптотически измененных клеток в любых тканях организма. Задача решается за счет того, что наряду с гистохимической обработкой гистологических срезов изучаемой ткани первоначально взвешивают образец исследуемой ткани или измеряют его объем, выделяют ядра из образца, затем окрашивают полученную ядерную суспензию красителями, окрашивающими концевые разрывы ДНК, после чего производят подсчет количества апоптотически измененных клеточных ядер, которое соответствует количеству апоптотически измененных клеток в изучаемом образце ткани, при этом производят перерасчет полученных данных на единицу объема или массы изучаемого образца ткани. Пример. Согласно протоколу 21 от 2.10.1999 проведены исследования, заключающиеся в том, что кусочек миокарда, выбранный для исследования, предварительно измерили и установили его объем. Ядра извлекали детергентным способом. Для этого измельченную ткань помещали в охлажденный буфер А, содержащий 30 мМ трис НС с рН 8,0 и 0,25 мМ сахарозу, 10 мМ Са 2 и 5 мМ 2-меркаптоэтанола. Ткань измельчали в гомогенизаторе в буфере А. Гомогенизат фильтровали, затем центрифугировали при 1500 в течение 10 минут. Осадок дважды промывали в буфере В, содержащем 0,1 тритон Х-100 в буфере А и переносили в физиологический раствор. Для окрашивания ДНК к осадку ядер в физиологическом растворе добавляли в равном количестве раствор, содержащий 0,5 пропидиума иодита на физиологическом растворе,забуференном фосфатом с рН 7,4, и содержащий 0,1 тритона Х-100 и 0,1 цитрата натрия. Подсчет апоптотически измененных ядер, т.е. подвергшихся окраске, осуществляли проточной цитофлюориметрией. Полученное количество апоптотически измененных ядер пересчитали на 1 мм 3 миокарда. Предлагаемый способ определения количества апоптотически измененных клеток в ткани обеспечивает высокую степень достоверности при работе с любыми видами тканей организма, легко воспроизводится, обладает относительно низкой себестоимостью. Источники информации 1. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Варфоломеев М.И. и др. Апоптоз и пролиферация как альтеративные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию // Иммунология. - 1999.2. - 20-23. 2. Коршунов А.Г., Сычева Р.В., Голанов А.В. Иммуногистохимическое изучение апоптоза в глиобластомах головного мозга // Архив патологии. - 1998. -3. - С. 23-27. - прототип. 3. Ципленкова В.Г., Бескровнова Н.Н. Морфология миокарда при синдроме ВольфаПаркинсона-Уайта // Архив патологии. - 1998. -6. - С. 13-18. - прототип. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 2