Способ получения дипептида L-лизил-L-глутаминовая кислота

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИПЕПТИДА -ЛИЗИЛ-ГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физикоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Книжников Валерий Алексеевич Зубрейчук Зинаида Петровна Черевин Михаил Сергеевич Гулевич Татьяна Геннадьевна Куваева Зоя Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения дипептида -лизилглутаминовая кислота, включающий получение защищенного дипептида взаимодействием производного -лизина с диалкильным эфиром -глутаминовой кислоты в растворителе при комнатной температуре, снятие защитных групп, осаждение продукта подкислением реакционной смеси уксусной кислотой и очистку конечного продукта переосаждением из водного раствора этанолом, отличающийся тем, что в качестве производного -лизина используют ,-бис(трифторацетил)-лизин, в качестве диалкильного эфира -глутаминовой кислоты - диметиловый эфир глутаминовой кислоты, взаимодействие проводят в растворе тетрагидрофурана в присутствии дициклогексилкарбодиимида, а снятие защитных групп осуществляют раствором едкого натра в этаноле. Изобретение относится к способу получения лекарственных средств на основе аминокислот, а именно дипептида -лизилглутаминовая кислота , (2-(2,6 диаминогексаноиламино)-пента-1,5-дионовая кислота) формулы 11596 1 2009.02.28 Вещества, обладающие иммуномодулирующей активностью, известны 1. К ним относятся препараты тимуса 2-4, полученные из животного сырья. Сложность способов получения, малый выход активных веществ, возможность возникновения у больных побочных реакций затрудняет использование этих препаратов. Применяемый иммуномодулирующий препарат тимоген 5, синтезирован на основе выделенной из тималина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии иммунноактивной фракции,представляет собой дипептид -глутамилтриптофан. Эффективность использования этого препарата снижается из-за сложности химического синтеза и нестабильности в растворе. Оптимальная доза препарата тимоген для внутримышечных иньекций составляет 100 мкг 1 раз в сутки в течение 5-10 дней. Известны способы получения дипептида 6, 7, который оказывает сильное иммуностимулирующее действие на показатели клеточного и гуморального иммунитета в дозах 100-1000 меньших, чем тимоген. Дипептид обладает более широким спектром действия на показатели неспецифической резистентности организма,усиливая функциональную активность фагоцитов и нейтрофилов в дозе в 100 раз меньшей, чем тимоген 1. Способность растворяться в воде дает возможность использовать его для инъекций. Химические методы синтеза дипептидов включают следующие основные стадии синтез защищенного дипептида и снятие защитных групп. Известен способ получения 7, который включает синтез защищенного дипептида - (,-дибензилоксикарбонил-лизилбензил-глутаминовая кислота) взаимодействием -бензилглутаминовой кислоты с -оксисукцинимидным эфиром ,дибензилоксикарбониллизина в диметилформамиде. Для снятия защитных групп защищенный дипептид растворяют в метаноле, добавляют воду и гидрируют над палладием на угле. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, остаток растворяют в минимальном количестве воды и высаждают метанолом. Продукт отфильтровывают, промывают этанолом и сушат в вакууме над Р 2 О 5. Т.пл. 194-196 С,2020,0(3,02) . Выход составляет 85 . Основными недостатками этого способа являются 1. Использование на стадии снятия защитных групп у защищенного дипептида дорогостоящего катализатора - палладия. 2. Применение на последней стадии выделения целевого продукта (высаждение дипептида) метанола-яда, который является нежелательным реагентом для получения фармацевтических препаратов. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ получения дипептида 6, прототип, который включает следующие основные стадии 1. Получение защищенного дипептида - диэтил-(дикарбобензокси лизил)глутамата. Диэтил-(дикарбобензоксилизил)глутамат получают взаимодействием азида дикарбобензоксилизина и диэтилового эфира -глутаминовой кислоты в эфире. Эфир удаляют при пониженном давлении. 2. Снятие защитных групп. На первой стадии снятия защитных групп ацетоновый раствор защищенного дипептида перемешивают с раствором едкого натра, фильтруют, подкисляют соляной кислотой,экстрагируют хлороформом, удаляют растворитель. Получают дикарбобензоксилизил-глутамат. На второй стадии образовавшийся дикарбобензоксилизилглутамат растворяют в метаноле, перемешивают с уксусной кислотой и палладием, затем растворитель упаривают. Вязкий остаток растворяют в воде, отгоняют воду, остаток снова растворяют в воде и высаждают спиртом, получают дипептид . Т.пл. 197 С,1922,9 . 11596 1 2009.02.28 Основными недостатками способа являются 1. Снятие защитных групп осуществляется в две стадии. 2. Использование дорогостоящего палладиевого катализатора для снятия защитных групп. Задача настоящего изобретения - упрощение и удешевление способа получения и выделения дипептида . Поставленная задача достигается тем, что в способе получения дипептида , включающем получение защищенного дипептида взаимодействием производных аминокислот, а именно производного -лизина с диалкильным эфиром -глутаминовой кислоты в растворителе при комнатной температуре, снятие защитных групп, высаждение продукта подкислением уксусной кислотой, очистку конечного продукта переосаждением из водного раствора этанолом, в качестве производного -лизина используют ,бис(трифторацетил)лизин, в качестве диалкильного эфира -глутаминовой кислоты диметиловый эфир -глутаминовой кислоты, взаимодействие проводят в растворе тетрагидрофурана в присутствии дициклогексилкарбодиимида, а снятие защитных групп осуществляют в одну стадию раствором едкого натра в этаноле. Использование трифторацетильных группировок в качестве амино-защитных групп обеспечивает легкость их снятия. Снятие защитных групп защищенного дипептида - диметилового эфира ,-бис(трифторацетил)лизилглутаминовой кислоты раствором едкого натра в этаноле значительно сокращает материальные затраты по получению целевого продукта. Использование этанола и на стадии выделения и на стадии очистки дипептида исключает наличие в конечном продукте метанола-яда. Предлагаемый способ получения дипептида иллюстрируется следующим примером Пример 1. 1. Получение защищенного дипептида - диметилового эфира ,-бис(трифторацетил)лизилглутаминовой кислоты осуществляют взаимодействием ,-бис(трифторацетил)лизина с диметиловым эфиром -глутаминовой кислоты. Для получения защищенного дипептида были получены ,-бис(трифторацетил)-лизин и диметиловый эфир -глутаминовой кислоты. Синтез ,-бис(трифторацетил)- -лизина. В стеклянный реактор, снабженный мешалкой, капельной воронкой и обратным холодильником заливают 300 мл безводного этанола и при интенсивном перемешивании порциями добавляют 4,60 г (200 ммоль) металлического натрия. После растворения натрия температуру реакционной смеси доводят до комнатной. К полученному раствору добавляют 18,25 г (100 ммоль) гидрохлоридализина. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч. К полученной суспензии по каплям добавляют 31,95 г (225 ммоль) этилового эфира трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 8 ч и обрабатывают 6,00 г (100 ммоль) уксусной кислоты. Растворитель отгоняют при пониженном давлении. Продукт реакции экстрагируют из остатка эфиром,эфирный раствор промывают водой и сушат сульфатом натрия. Эфирный раствор фильтруют, обрабатывают 250 мл гексана и концентрируют отгонкой растворителя в вакууме. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают гексаном, сушат в вакууме. Получают 27,90 г (82,5 ммоль) ,-бис(трифторацетил)лизина. Выход 82,5 . Синтез диметилового эфира -глутаминовой кислоты осуществляли по методике, описанной в литературе 8. В стеклянный реактор, снабженный мешалкой, капельной воронкой и обратным холодильником, заливают 30 мл безводного метанола и при интенсивном перемешивании добавляют 50 г хлористого тионила. Смесь охлаждают до -10 С и при перемешивании добавляют 14,71 г (100 ммоль) -глутаминовой кислоты. Реакционную смесь нагревают и перемешивают в течение 5 ч при 50 С. Растворитель отгоняют при пониженном давле 3 11596 1 2009.02.28 нии. Полученный остаток растворяют в хлористом метилене, к раствору добавляют 12,12 г(120 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивают 3 ч и растворитель удаляют в вакууме. Продукт реакции из остатка экстрагируют эфиром, эфирный раствор промывают водой,сушат над сульфатом натрия. После отгонки эфира при пониженном давлении получают 14,64 г (выход 83,6 ) диметилового эфира -глутаминовой кислоты, который используют на стадии получения защищенного дипептида - ,-бис(трифторацетил)лизил-глутаминовая кислота. Получение защищенного дипептида. В стеклянный реактор, снабженный мешалкой, капельной воронкой и обратным холодильником, помещают раствор 27,90 г (82,5 ммоль) ,-бис(трифторацетил)лизина в 150 мл тетрагидрофурана. При интенсивном перемешивании добавляют раствор 17,01 г(82,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 100 мл тетрагидрофурана. Смесь перемешивали 5 минут и к ней через капельную воронку добавляют раствор 14,45 г (82,5 ммоль) диметилового эфира -глутаминовой кислоты в 100 мл тетрагидрофурана. После перемешивания в течение 24 часов смесь фильтруют и растворитель отгоняют в вакууме. К полученному остатку добавляют 100 мл эфира и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 30 минут. Выпавший после охлаждения смеси осадок отфильтровывают, промывают гексаном, сушат в вакууме. Получают 34,49 г (69,63 ммоль) диметилового эфира,-бис(трифторацетил)лизилглутаминовой кислоты. Выход 84,4 . 2. Снятие защитных групп осуществляли следующим образом К раствору 34,49 г (69,63 ммоль) диметилового эфира ,-бис(трифторацетил)-лизилглутаминовой кислоты в 150 мл этанола добавляют раствор 11,28 г (282 ммоль) едкого натра в 50 мл этанола. Смесь перемешивают 10 ч и обрабатывают 8,56 г(142,74 ммоль) уксусной кислоты. Полученный осадок отфильтровывают, промывают этанолом, сушат в вакууме, растворяют в минимальном количестве воды при нагревании и высаждают этанолом (в соотношении вода этанол 110), выпавший осадок отфильтровывают, промывают охлажденным этанолом и сушат в сушильном вакуумном шкафу при 40 С. Получают 15,26 г (55,43 ммоль) дипептида . Выход 79,6 . Выход целевого продукта дипептида составляет 55,43 по исходным соединениям. Полученный дипептид -лизилглутаминовая кислота представляет собой мелко 20 кристаллический белый порошок без запаха с т.пл. 195-197 С,21,6(3,02 ) . Пример по прототипу 6. 1. Получение защищенного дипептида - диэтил-(дикарбобензокси лизил)глутамата. Диэтил-(дикарбобензоксилизил)глутамат получают путем взаимодействия азида дикарбобензоксилизина и диэтилового эфира -глутаминовой кислоты в эфире. Эфир удаляют при пониженном давлении. Выход 45 . 2. Снятие защитных групп. 7,3 г защищенного дипептида в 120 мл ацетона перемешивают с 34 мл раствора едкого натра, фильтруют, подкисляют 5 н раствором соляной кислоты и концентрируют при пониженном давлении, остаток экстрагируют хлороформом, удаляют растворитель и получают 6,0 г дикарбобензоксилизилглутаминовой кислоты. Выход 90 . Затем 3,0 г полученного дипептида (дикарбобензоксилизилглутамат) в метаноле и воде обрабатывают 1 мл уксусной кислоты и палладием. Через 40 мин выделение 2 прекращается и растворитель упаривают. Вязкий остаток растворяют в воде, отгоняют воду, остаток снова растворяют в воде и высаждают спиртом, получают дипептид почти с коли 19 чественным выходом. Т.пл. 197 С,22,9. Выход дипептида составляет 40,5 по исходным соединениям. 11596 1 2009.02.28 Таким образом, разработанный способ получения дипептида -лизилглутаминовая кислота имеет следующие преимущества по сравнению со способом получения дипептида по прототипу 1. Предлагаемый способ позволяет повысить выход целевого продукта по исходным соединениям. 2. Использование трифторацетильных группировок в качестве аминозащитных групп позволяет проводить снятие защитных группировок в одну стадию и исключить использование дорогостоящего катализатора - палладия, что значительно сокращает материальные затраты по получению целевого продукта. Источники информации 1.2080120 , МПК А 61 К 38/05, 1997. 2.,., . . . . . - 1972. - . 69. -7. . 1800-1803. 3. Машковский М.Д. - М. Медицина, 1988. Т.2. Гл.9. - С. 168-175. 4. Арион В.Я. Иммунобиология гормонов тимуса. - Киев Здоровья, 1989. - С. 103-125. 5. Яковлев Г.М., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. и др. Тез. докл. науч. конф. Биохимия медицине. - Л., 1988. - С. 217-218. 6..,.. - 1932. - 65.10. - . 1692-1696. 7.- . - , 1987/88.- 40. 8..,.,-, . - 1953. - 35. -5. - . 1109-1115. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5