Реакционный состав для определения активности фосфат-зависимой глутаминазы в биологических образцах

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ РЕАКЦИОННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФАТ-ЗАВИСИМОЙ ГЛУТАМИНАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Валюк Татьяна Чеславовна Величко Магдалена Григорьевна Нефедов Леонид Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси(57) Реакционный состав для определения активности фосфат-зависимой глутаминазы в биологических образцах, содержащий трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид, ортофосфат калия, -глутамин и воду дистиллированную, отличающийся тем, что дополнительно содержит хлорид калия, динатриевую соль малеиновой кислоты, никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД), -метилфеназинметосульфат и дихлорфенолиндофенол при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л-глутамин хлорид калия динатриевая соль малеиновой кислоты НАД 6839 1 Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано для оценки процесса утилизации глутамина в различных биологических образцах. Фермент фосфат-зависимая глутаминаза катализирует реакцию гидролиза глутамина с образованием глутаминовой кислоты и аммиака, протекающую при обязательном наличии фосфат-ионов.,,.// . . ., 2001. - . 66. -5. - . 951-958. Наиболее близким к заявляемому является реакционный состав для определения активности фосфат-зависимой глутаминазы по наработке аммиака, содержащий трис(оксиметил)-аминометан гидрохлорид в концентрации 100 мкмоль/л, ортофосфат калия 100 мкмоль/л, -глутамин - 40 мкмоль/л, воду безаммиачную - остальное.// 1974. - . 334. -1. - . 199207. Для остановки реакции необходимы трихлоруксусная кислота, карбонат калия, серная кислота и нитропруссид-феноловый реактив Исмаилов И.А., Эмирбеков Э.З. Глутаминазная и глутаматдекарбоксилазная активность ткани мозга при гипотермии и зимней спячке // Укр. биохим. жур. - 1980. - Т. 52. -6 - С. 683-688. Недостатками данного реакционного состава являются обязательное наличие безаммиачной воды, выпадение осадка после остановки реакции, что требует дополнительного центрифугирования проб перед работой на регистрирующих приборах работа с токсичными веществами (ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты) длительность процесса постановки реакции для определения активности вследствие получасовой инкубации проб и дополнительного центрифугирования получение активности с разбежкой данных в широком диапазоне. Задачей изобретения является создание нового реакционного состава для выявления активности фосфат-зависимой глутаминазы по наработке глутамата, сокращения времени постановки реакции, повышения доступности и надежности определения. Указанная задача достигается тем, что в реакционный состав по сравнению с прототипом добавлены хлорид калия, малеат, никотинамидадениндинуклеотид окисленный, метилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол, снижена концентрация глутамина,исключены ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты. Это способствует повышению надежности, доступности определения активности фосфат-зависимой глутаминазы в промежутке времени 10 мин при оптимальной температуре инкубации среды (37 ). Заявленный состав содержит трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид, ортофосфат калия, -глутамин, динатриевую соль малеиновой кислоты, хлорид калия, никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД), -метилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л трис-(оксиметил)аминометан гидрохлорид - 99,5-100 ортофосфат калия - 99,5-100 -глутамин - 19,5-20,0 хлорид калия - 0,09-0,10 динатриевая соль малеиновой кислоты - 24,5-25,0 НАД - 10,0-метилфеназинметосульфат - 0,0065 ДХФИФ - 0,02 вода дистиллированная - остальное. Предложенные нововведения обосновываются следующим образом 1. хлорид калия является источником однозарядных ионов для поддержания кислотности реакционной среды 2. малеиновая кислота является активатором фермента.,В.,.. 1.. 2.// . . , 1970. - . 245. -8. - . 1871-1882 3. введение активатора позволяет снизить концентрацию -глутамина до 20 мкмоль/л 4. никотинамидадениндинуклеотид окисленный облегчает двусторонний обмен атомами водорода и электронами, отделенными от субстрата, между глутаматдегидрогеназной системой и акцепторами электронов Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека. . Мир, 1980. - С. 118 2 6839 1 5. -метилфеназинметосульфат - акцептор электронов, осуществляющий перенос электронов на последующий акцептор (дихлорфенолиндофенол) 6. дихлорфенолиндофенол - акцептор электронов, снимающий электроны с -метилфеназинметосульфата, в результате чего развивается окраска акцептора от темно-синей(при образовании окисленной формы) до светло-голубой (при образовании восстановленной формы). Заявленный реакционный состав использовали для определения активности фосфатзависимой глутаминазы в шести образцах из тканей печени и опухоли крыс-опухоленосителей саркомы -1 в трех независимых сериях опытов. За ходом реакций следили по приросту оптической плотности вследствие наработки продукта на регистрирующих приборах - спектрофотометры -2 и -221, при 600 нм. В таблице представлены полученные расчетные данные по активности фосфат-зависимой глутаминазы из тканей крыс-опухоленосителей с применением заявленного реакционного состава. Активность фосфат-зависимой глутаминазы, полученная путем применения заявленного реакционного состава в различных сериях опытов, мкмоль ДХФИФ/мин-г белка Образец ткани печени опухоли Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют об оптимальном соотношении компонентов заявленного реакционного состава в диапазоне указанных выше концентраций, поскольку это не дает большой вариации данных по активности фосфат-зависимой глутаминазы, позволяет получать воспроизводимые результаты. Заявленный реакционный состав для определения активности фосфат-зависимой глутаминазы может быть широко использован в биохимической и медицинской практике для диагностики злокачественных новообразований и разработки стратегии их лечения, поскольку изменение активности фермента в раковой ткани коррелирует со степенью ее злокачественности. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.