Способ оценки активности проникающего в клетки водорастворимого антиоксиданта

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ПРОНИКАЮЩЕГО В КЛЕТКИ ВОДОРАСТВОРИМОГО АНТИОКСИДАНТА(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Мартинович Григорий Григорьевич Мартинович Ирина Викторовна Черенкевич Сергей Николаевич Голубева Елена Николаевна(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) Способ оценки активности проникающего в клетки водорастворимого антиоксиданта,включающий использование эритроцитов, которые выделяют из крови путем центрифугирования, отличающийся тем, что выделенные эритроциты инкубируют при 37 С в течение 30 мин в изотоническом фосфатном буфере 7,4, содержащем 0,005 ммоль/л 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата, дважды отмывают изотоническим фосфатным буфером 7,4, разделяют на две пробы, в первую пробу вносят испытуемый антиоксидант и инкубируют при 37 С в течение 2 мин, затем в обе пробы вносят пероксид водорода до концентрации 1,0 ммоль/л и инкубируют при 37 С в течение 5 мин, после чего измеряют интенсивности флуоресценциипервой и 0 второй проб при длине волны 530 нм при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 488 нм и оценивают активность антиоксиданта Ак в клетках по формулек 0 100 . 0 Изобретение относится к фармакологии, к экспериментальной и клинической медицине и может быть использовано при разработке и оценке активности новых антиоксидантов. Известен способ оценки активности антиоксидантов, заключающийся в том, что в первую из двух одинаковых проб, содержащих клетки гепатокарциномы линии 2, вносится исследуемый препарат и в первой и второй пробах определяется интенсивность 2,7-дихлорфлуоресцеина, образующегося при окислении 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина продуктами свободнорадикальных реакций, инициируемых 2,2-азо-бис-(2-амидинопропан)гидрохлоридом, затем по величине уменьшения интенсивности 2,7-дихлорфлуоресцеина в первой пробе в сравнении со второй делают вывод об антиоксидантной активности препарата 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Однако способ-прототип обладает недостатками. 2,2-азо-бис-(2-амидинопропан)гидрохлорид индуцирует образование пероксильных радикалов во внеклеточной среде 2, по 18425 1 2014.08.30 этому определяемая в способе-прототипе антиоксидантная активность преимущественно характеризует способность препарата удалять пероксильные радикалы во внеклеточной среде. Для более точной оценки активности водорастворимых антиоксидантов необходимо определять способность антиоксидантов удалять окислители, преимущественно образующиеся в физиологических и патофизиологических условиях. В способе-прототипе используются клетки гепатокарциномы линии 2, в которых содержание антиоксидантов значительно выше, чем в остальных типах клеток человека, в результате чего ряд препаратов, обладающих антиоксидантной активностью в остальных типах клеток, в клетках гепатокарциномы линии 2 не способен удалять окислители. Получение клеток гепатокарциномы линии 2 осуществляется с использованием дорогостоящего оборудования (ламинар, 2-инкубатор) и реактивов (питательная среда, сыворотка) в течение 24 ч. Задачей предлагаемого изобретения является создание способа оценки активности проникающего в клетки водорастворимого антиоксиданта, обеспечивающего повышение точности оценки активности антиоксидантов и снижение технических и материальных затрат. Поставленная задача решается в способе оценки активности водорастворимых антиоксидантов, заключающемся в том, что выделенные эритроциты инкубируют в изотоническом фосфатном буфере с 7,4, содержащем 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат в концентрации 0,0050,001 ммоль/л, в течение 30 мин при температуре 37 С, затем эритроциты дважды отмывают в изотоническом фосфатном буфере с 7,4, готовят две равные по объему пробы, после чего в одну из проб вносят водорастворимый антиоксидант и инкубируют в течение 2 мин в обе пробы вносят пероксид водорода в концентрации 1,0000,001 ммоль/л и инкубируют в течение 5 мин при температуре 37 С, затем спетрофлуориметрическим методом определяют интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина в первой и второй пробах и по величине уменьшения интенсивности 2,7-дихлорфлуоресцеина в первой пробе в сравнении со второй делают вывод об антиоксидантной активности препарата. Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофлуориметр. Выделенные путем центрифугирования эритроциты в количестве 107 кл/мл в 2 мл изотонического фосфатного буфера с 7,4, содержащего 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат в концентрации 0,0050,001 ммоль/л,вносят в кварцевую кювету и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 С. После этого клетки дважды отмывают в изотоническом фосфатном буфере с 7,4 и разделяют на две равные по объему пробы. В первую пробу вносят антиоксидант. Затем через 2 мин в обе пробы вносят пероксид водорода в концентрации 1,0000,001 ммоль/л и после 5 мин инкубирования измеряют интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны флуоресценции 530 нм. По величине уменьшения интенсивности 2,7-дихлорфлуоресцеина в первой пробе в сравнении со второй делают вывод об антиоксидантной активности препарата. При окислительном стрессе образуются свободные радикалы и нерадикальные окислители, среди которых наиболее стабильным является пероксид водорода. Окислительный стресс сопровождает многие заболевания человека, поэтому в медицинской практике активно используются антиоксидантные препараты. Антиоксидантная активность препаратов не одинакова по отношению к свободным радикалам и нерадикальным окислителям. В клетках более 99 повреждений биомолекул вызываются нерадикальными окислителями 3. Поэтому в новом способе в качестве адекватного и биологически значимого окислителя используется пероксид водорода. Для регистрации пероксида водорода в эритроцитах используется флуоресцентный зонд 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат. 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат легко проникает в клетку, где под действием внутриклеточных эстераз переходит в форму 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина - 2,7-дихлордигидро 2 18425 1 2014.08.30 флуоресцеин - слабо флуоресцирующий агент, который в реакциях с пероксидом водорода превращается в интенсивно флуоресцирующий продукт 2,7-дихлорфлуоресцеин. Поскольку интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при окислении пероксидом водорода зависит от концентрации водорастворимых антиоксидантов, то, измеряя интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина, можно оценить антиоксидантную активность водорастворимых препаратов. Сущность изобретения поясняется примером. Пример. Необходимо провести оценку антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты,фенозана калия и 3-(3-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропилтиосульфоната натрия в растворе без клеток и с клетками. Для оценки антиоксидантной активности в растворе в первую из двух одинаковых проб с изотоническим фосфатным буфером с рН 7,4,содержащим 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин в концентрации 0,005 ммоль/л, вносили исследуемый препарат в концентрации 0,1 ммоль/л. Затем через 2 мин в обе пробы вносили пероксид водорода в концентрации 1 ммоль/л и после инкубирования в течение 5 мин измеряли интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны флуоресценции 530 нм. Антиоксидантную активность в растворе рассчитывали по формулеАп 0 100,0 где Ап - показатель антиоксидантной активности препарата в растворе 0 - интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны флуоресценции 530 нм после инкубирования раствора с пероксидом водорода в течение 5 мин- интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны флуоресценции 530 нм после инкубирования раствора с исследуемым препаратом и пероксидом водорода в течение 5 мин. Для оценки антиоксидантной активности с клетками выделенные эритроциты в количестве 107 кл/мл инкубировали в изотоническом фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат в концентрации 0,005 ммоль/л, в течение 30 мин при температуре 37 С, после чего клетки дважды отмывали в изотоническом фосфатном буфере с 7,4 и разделяли на две равные по объему пробы. В первую пробу вносили исследуемый препарат в концентрации 0,1 ммоль/л. Затем через 2 мин в обе пробы вносили пероксид водорода в концентрации 1 ммоль/л и измеряли интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны флуоресценции 530 нм после инкубирования в течение 5 мин. Антиоксидантную активность с клетками рассчитывали по формулеАк 0 100,0 где Ак - показатель антиоксидантной активности препарата в растворе 0 - интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны флуоресценции 530 нм после инкубирования эритроцитов с пероксидом водорода в течение 5 мин- интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны флуоресценции 530 нм после инкубирования эритроцитов с исследуемым препаратом и пероксидом водорода в течение 5 мин. Полученные результаты приведены в таблице. Анализ данных таблицы позволяет сделать вывод о том, что при окислении 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина в клетках максимальная антиоксидантная активность наблюдается у аскорбиновой кислоты, а фенозан калия не проявляет антиоксидантную активность. 3 18425 1 2014.08.30 Показатели антиоксидантной активности препаратов Название препарата Аскорбиновая кислота Фенозан калия 3-(3-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия Таким образом, заявляемый способ в сравнении с прототипом обладает следующими преимуществами позволяет повысить точность оценки антиоксидантной активности препарата путем определения антиоксидантной активности препарата по отношению к преимущественно образующемуся в патофизиологических условиях пероксиду водорода позволяет сократить время, необходимое для проведения анализа не требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4