Способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИБРИНОГЕНЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ(71) Заявитель Учреждение образования Полесский государственный университет Национального банка Республики Беларусь(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Учреждение образования Полесский государственный университет Национального банка Республики Беларусь(57) Способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с использованием 0,15 растворас 7,5, в который добавлен агар до концентрации 1 , пирофосфат натрия до концентрации 10-6-10-2 и бычий фибриноген в количестве 20 г на 1 л раствора , наносят 15 мкл суспензии клеток условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 С в течение 24 ч и оценивают фибриногенлитическую активность условно-патогенных микроорганизмов по площади зоны лизиса фибриногена. Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к оценке протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов. В настоящее время определение протеолитической активности условно-патогенных микроорганизмов затруднено, поскольку используемые для такого анализа белковые субстраты - казеин, гемоглобин, желатин, альбумин, фибрин 1,2 - в обычных условиях часто не расщепляются протеиназами микроорганизмов. Между тем оценка расщепления этих субстратов чрезвычайно важна для общебиологических исследований биохимическая дифференциация видов и штаммов, например, рода 3, рода 4 и др., а также для прикладных целей создания или изыскания прежде всего специфических ингибиторов протеиназ, учитывая важную роль этих энзимов в жизнедеятельности патогенных микроорганизмов и патогенезе ряда заболеваний бактериальной этиологии. 16958 1 2013.04.30 Известен способ определения протеолитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что аликвоты суспензии клеток в 0,15 растворенаносят на белок-агаровые пластины, содержащие в качестве субстрата гемоглобин или казеин в концентрации 10 г/л, агар Дифко, а также 0,15 М раствор ,7,4, инкубируют пластины при 37 С в течение 24 ч, обрабатывают их 2 н трихлоруксусной кислотой и учитывают протеолитическую активность по степени расщепления белка субстрата, измеряя площадь зон лизиса белка, обусловленного действием на субстрат активных протеолитических энзимов 5. Указанный способ является прототипом в отношении заявляемому. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются добавление исследуемых образцов к белок-агаровой пластине, инкубация при температуре 37 С и определение меры расщепления белкового субстрата. Однако недостатком прототипа является низкая чувствительность способа, что часто не позволяет вообще выявить наличие протеолитической активности в исследуемом образце. Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности способа выявления нейтральной протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с использованием 0,15 М раствора , 7,5, в который добавлен агар до концентрации 1 , пирофосфат натрия до концентрации 10-6-10-2 и бычий фибриноген в количестве 20 г на 1 л раствора , наносят 15 мкл суспензии клеток условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 С в течение 24 ч и оценивают фибриногенлитическую активность условно-патогенных микроорганизмов по площади зоны лизиса фибриногена. Использование при приготовлении белок-агаровой пластины фибриногена быка и пирофосфата натрия позволяет значительно повысить чувствительность способа определения нейтральной протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов. Пример. Готовят 8 пластин 1 -ного агарана 0,15 растворе ,7,5, содержащих фибриноген быка в концентрации 2 . Пластину 1 готовят с использованием в качестве растворителя 0,15 раствора,7,5, без добавок (контроль). Остальные пластины готовят с использованием в качестве растворителя 0,15 раствора ,7,5, с добавлением пирофосфата натрия в концентрациипластину 2 - 10-2 пластину 3 - 10-3 пластину 4 - 10 пластину 5 - 10-5 пластину 6 - 10-6 пластину 7 - 10-7 пластину 8 - 10-8. На все пластины наносят микродозатором по 15 мкл суспензий клеток, выделенных при центрифугировании из суточных бульонных культур 10 различных штаммов условно-патогенных микроорганизмов. Затем инкубируют все фибриноген-агаровые пластины с нанесенными на поверхность образцами при 37 С в течение 24 ч. Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют площадь зон расщепления фибриногена в мм 2. Результаты определения площади зон расщепления фибриногена представлены в таблице. Из данных таблицы видно, что определение активности нейтральных протеиназ клеток условно-патогенных микроорганизмов возможно только в присутствии в реакционной системе пирофосфата натрия в концентрации 10-6-10-2 . 16958 1 2013.04.30 Влияние пирофосфата натрия на расщепление фибриногена быка(мм площади зон лизиса) нейтральными фибриногенолитическими протеиназами клеток различных условно-патогенных микроорганизмов. Растворитель при приготовлении геля - 0,15 раствор ,7,5,(представлены средние значения,4) 2 Источники информации 1. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта и др. 9-е изд. - М. Мир. 1997. - Т. 1. - С. 237. 2. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта и др. 9-е изд. - М. Мир. 1997. - Т. 2. - С. 603. 3. Методы определения протеолитической активности и выделения протеолитических ферментов. В кн. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов (методы исследования). - Л. Наука., 1979. - С. 24-33. 4. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. - Киев Науковая думка, 1985. - С. 55-76. 5. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шатило Н.Л. Протеолитическая и эндонуклеазная активность штаммовпри росте на питательных средах сложного состава. . Нейтральные деполимеразы // Роль антропогенных и природных патогенов в формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека. Медикоэкологич. аспекты проблемы. Матер. междунар. конфер. - Минск, 2002. - С. 326-342. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3