Способ оценки состояния антиоксидантной системы эритроцитов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЭРИТРОЦИТОВ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Мартинович Григорий Григорьевич Мартинович Ирина Викторовна Черенкевич Сергей Николаевич(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) Способ оценки состояния антиоксидантной системы эритроцитов, заключающийся в том, что эритроциты в количестве 107 кл/мл инкубируют в течение 30 мин при 37 С в изотоническом фосфатном буфере 7,4, содержащем 0,005 ммоль/л 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата, дважды отмывают изотоническим фосфатным буфером 7,4,разделяют на две пробы, вносят пероксид водорода до концентрации 0,1 ммоль/л в первую пробу и до концентрации 4,5 ммоль/л во вторую пробу, инкубируют пробы в течение 5 мин при 37 С, определяют интенсивности флуоресценции 1 и 2 соответственно первой и второй пробы при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм и оценивают состояние антиоксидантной системы эритроцитов как более активное по более высокому значению отношения 2 к 1. Изобретение относится к медицине, к области лабораторной диагностики. Известен способ оценки состояния антиоксидантной системы эритроцитов путем фотоколориметрического определения концентрации восстановленного глутатиона в надосадочной жидкости после разрушения эритроцитов 1. Однако указанный способ обладает недостатками. В способе-прототипе измеряется концентрация только одного компонента антиоксидантной системы эритроцитов. Для более точной оценки функционального состояния антиоксидантной системы эритроцитов необходимо учитывать также изменения концентрации других антиоксидантов (аскорбиновая кислота, никотинамиддинуклеотид фосфат) и активности ферментов антиоксидантной системы (каталазы и пероксидазы). В способе-прототипе из-за возможного окисления глутатиона при разрушении клеток также снижается точность оценки функционального состояния антиоксидантной системы эритроцитов. Использование азида натрия снижает активность компонента антиоксидантной системы эритроцитов - каталазы. Задачей предлагаемого изобретения является создание способа оценки состояния антиоксидантной системы эритроцитов, обеспечивающего повышение точности оценки функционального состояния антиоксидантной системы эритроцитов. 16630 1 2012.12.30 Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ оценки состояния антиоксидантной системы эритроцитов, заключающийся в том, что эритроциты в количестве 107 кл/мл инкубируют в течение 30 мин при 37 С в изотоническом фосфатном буфере 7,4, содержащем 0,005 ммоль/л 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата, дважды отмывают изотоническим фосфатным буфером 7,4, разделяют на 2 пробы, вносят пероксид водорода до концентрации 0,1 ммоль/л в первую пробу и до концентрации 4,5 ммоль/л во вторую пробу, инкубируют пробы в течение 5 мин при 37 С, определяют интенсивности флуоресценции 1 и 2 соответственно первой и второй пробы при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм и оценивают состояние антиоксидантной системы эритроцитов как более активное по более высокому значению отношения 2 к 1. Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофлуориметр. Выделенные путем центрифугирования эритроциты в количестве 107 кл/мл в изотоническом фосфатном буфере 7,4, содержащем 005 ммоль/л 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата, вносят в кварцевую кювету объемом 2 мл и инкубируют в течение 30 мин при 37 С. После этого клетки дважды отмывают в изотоническом фосфатном буфере 7,4 и разделяют на 2 пробы. В первую пробу вносят пероксид водорода до концентрации 0,1 ммоль/л и после 5 мин инкубирования измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм. Во вторую пробу вносят пероксид водорода до концентрации 4,5 ммоль/л и после 5 мин инкубирования измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм. Состояние антиоксидантной системы эритроцитов оценивают как более активное по более высокому значению отношения 2 к 1. Для регистрации пероксида водорода в эритроцитах используется флуоресцентный зонд - 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат. 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат легко проникает в клетку, где под действием внутриклеточных эстераз переходит в форму 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина. 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин - слабо флуоресцирующий агент, который в реакциях с пероксидом водорода превращается в интенсивно флуоресцирующий продукт - 2,7-дихлорфлуоресцеин. Поскольку интенсивность флуоресценции 2,7 дихлорфлуоресцеина при окислении пероксидом водорода зависит от концентрации антиоксидантов и активности ферментов антиоксидантной системы, то измеряя интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина можно оценить состояние антиоксидантной системы эритроцитов. При ряде патологических состояний (острый коронарный синдром,сахарный диабет 2-го типа) происходит изменение активности антиокидантной системы эритроцитов, в результате которой возрастает интенсивность флуоресценции 2,7 дихлорфлуоресцеина при окислении пероксидом водорода в концентрации 0,1 ммоль/л и снижается интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при окислении пероксидом водорода в концентрации 4,5 ммоль/л 2. Сущность изобретения поясняется примером. Пример. Образцы крови были взяты у здоровых доноров ( 1,3), у пациентов с острым коронарным синдромом ( 2) и сахарным диабетом 2-го типа ( 4). Необходимо произвести оценку состояния антиоксидантной системы эритроцитов 4 доноров. Для этого выделенные эритроциты в количестве 107 кл/мл в течение 30 мин инкубировали при 37 С в изотоническом фосфатном буфере 7,4, содержащем 0,005 ммоль/л 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата, после чего клетки дважды отмывали изотоническим фосфатным буфером 7,4 и разделяли на 2 пробы. В первую пробу вносили пероксид водорода до концентрации 0,1 ммоль/л и после 5 мин инкубирования измеряли интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм. Во вторую пробу вносили пероксид водорода до кон 2 16630 1 2012.12.30 центрации 4,5 ммоль/л и после 5 мин инкубирования измеряли интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм. Оценку функционального состояния антиоксидантной системы эритроцитов проводили путем определения величины отношения интенсивностей флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина во второй и первой пробах. Величину отношения интенсивностей флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина во второй и первой пробах рассчитывали согласно формуле 2 ,1 где- показатель состояния антиоксидантной системы эритроцитов 1 - интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм после 5 мин инкубирования эритроцитов с 0,1 ммоль/л пероксида водорода 2 - интенсивность флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина при длине волны флуоресценции 530 нм и длине волны возбуждения 488 нм после 5 мин инкубирования эритроцитов с 4,5 ммоль/л пероксида водорода. Полученные результаты приведены в таблице. Показатели состояния антиоксидантной системы эритроцитов Номер образца 1 11,2 2 7,6 3 14 4 5,4 Анализ данных таблицы позволяет сделать вывод о том, что в указанной группе образцов максимальная активность антиоксидантной системы эритроцитов наблюдается у донора под 3, а минимальная активность антиоксидантной системы эритроцитов наблюдается у донора под 4. Таким образом, заявляемый способ в сравнении с прототипом обладает следующими преимуществами позволяет повысить точность оценки функционального состояния антиоксидантной системы эритроцитов путем комплексной оценки состояния антиоксидантной системы с учетом изменения активности антиоксидантных ферментов и концентрации внутриклеточных антиоксидантов позволяет снизить количество клеток, необходимое для анализа не требует разрушения клеток. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3