Штамм бактерий Salmonella dublin КМИЭВ-В124 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Финогенов Артм Юрьевич Лемиш Артм Петрович Андрусевич Андрей Сергеевич Финогенова Елена Геннадьевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56) Технология производства вакцин против сальмонеллеза телят и поросят Учебно-методическое пособие для студентов, аспирантов по специальности Ветеринарная медицина и работников биопредприятий. - Витебск,2004. - С. 4-21.2218176 2, 2003.36863 , 2008.20240 , 2007.65815 , 2004. МЕДВЕДЕВ А.П. и др. Ветеринарная наука - производству. Научные труды. Вып. 40. - Т. 2. - Минск, 2009-2010. С. 30-36. АМОСОВА Л.А. и др. Эпизоотология,иммунобиология, фармакология, санитария. - 2010. -2. - . 54-57.(57) Штамм бактерийКМИЭВ-В 124 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается штамма, выделенного от пушных зверей, больных сальмонеллезом, обладающего низкой токсичностью и предназначенного для конструирования лечебно-профилактических и диагностических препаратов при данном заболевании. Известен штамм, обладающий недостаточной выживаемостью бактерий, используемый для изготовления биопрепаратов, обладающий низкой концентрацией микробных клеток. При этом концентрация микробных клеток данного штамма составила 23 млрд. в 1 мл 1. Данный штамм обладает недостаточной выживаемостью бактерий и низкой концентрацией микробных клеток для изготовления биопрепаратов в больших объемах. Известен штамм 6, обладающий низкой патогенностью значение 50 которого для белых мышей массой 14-16 г составляет 107 микробных клеток, а для 18101 1 2014.04.30 морских свинок массой 400 г - 1010 микробных клеток. Иммуногенность которого составляет 75 . Антигенная активность - 6 2. На МПА штамм через 24 ч роста образует колонии -формы, на МПБ - через 10-12 ч вызывает равномерное помутнение среды, а на МППЖА через 24 ч - диффузный рост. Штамм при посеве на среды, содержащие углеводы и многоатомные спирты, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, манит, ксилозу, дульцит, арабинозу,сорбит, образует сероводород, не образует индол 2. Недостатком данного штамма является то, что он апатогенен для лабораторных животных, и изготовление вакцин из такого штамма может привести к снижению антигенной и иммуногенной активности, а следовательно, и защитных свойств. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма, обладающего высокой выживаемостью бактерий, наибольшей концентрацией микробных клеток, патогенностью, антигенностью и иммуногенностью для изготовления вакцин. Поставленная задача достигается тем, что штамм бактерийКМИЭВВ 124 - штамм-антиген - выделен из селезенки норки трехмесячного возраста, больной сальмонеллезом, в 2008 г. в Гродненском с/х отделении Гродненское зверохозяйство Гродненского района Гродненской области. Штамм бактерийКМИЭВ-В 124 - штамм-антиген - депонирован в коллекции микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. Коллекционный номер КМИЭВ-В 124. Таксономическая принадлежность. Микроорганизм отнесен к видуродасемейства . Патогенность для животных. Штамм бактерийКМИЭВ-В 124 штамм-антиген - патогенен для пушных зверей и лабораторных животных при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. Культурально-морфологические признаки. Микроорганизм в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, окрашенных по Граму, имеет вид мелких грамотрицательных палочек размером 0,7-1,52-5 мкм, располагающихся изолированно, реже парами, цепочками. Культура сальмонелл подвижная, спор и капсул не образует. Факультативный анаэроб. В МПБ, бульоне на основе перевара Хоттингера, в первый день выращивания дает легкое равномерное помутнение среды на 2-4 день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании пробирки в виде косички с просветлением бульона. На МПА, агаре на основе перевара Хоттингера,образует мелкие прозрачные круглые с ровными краями колонии слизистой консистенции диаметром 1,0-3,0 мм. На агаре Эндо растет в виде серовато-голубых прозрачных круглых колоний, на висьмут-сульфитном агаре - темно-зеленых колоний с ровными краями. Биохимические свойства. Штамм бактерийКМИЭВ-В 124 - штаммантиген - обладает способностью ферментировать ксилозу, арабинозу, глюкозу, маннит,сорбит с образованием кислоты без газа, не ферментирует сахарозу, лактозу, раффинозу,мальтозу, дульцит, образует индол, сероводород, утилизирует цитраты, не продуцирует гемолизин и уреазу. Антигенный состав. Имеет в своем составе - и -антигены. Другие особенности и маркерные свойства. Типизацию сальмонелл проводят согласно Наставлению по применению наборов сывороток сальмонеллезных -комплексных и монорецепторных - и -агглютинирующих. Способы и условия хранения. Хранят в ампулах после лиофильного высушивания в сахарозо-желатиновой среде при температуре ( 2)-( 4) С в течение 5 лет. Сохранность культуры обеспечивается путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера, МПА на основе перевара Хоттингера - 1 раз в течение месяца. 18101 1 2014.04.30 Антигенные свойства. Антигенная активность штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена - в РНГА составляет 7 2. Иммуногенность штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена - составляет 100 . Вирулентность. Штамм бактерийКМИЭВ-В 124 - штамм-антиген обладает высокой вирулентностью 50, которая составляет для белых мышей 0,2104 м.к., а для морских свинок - 0,3108 м.к. Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к антибактериальным препаратам канамицину, левомицетину, гентамицину, флумеквину (флумизолу), энроксилу( 5), спектиномицину, окситетрациклину. Пример 1. Выделение штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена. Штамм бактерийКМИЭВ-В 124 - штамм-антиген - выделен при посеве кусочков селезенки на границе патологической и здоровой ткани на мясо-пептонный бульон с добавлением 0,2 мл аминопептида-2 на пробирку. В первые сутки выращивания отмечали легкое равномерное помутнение среды, иногда образование пристеночного кольца. Через 7-10 дней хранения при температуре ( 2)-( 4) С на дне пробирки образовывался характерный слизистый осадок с полным просветлением бульона. Пример 2. Определение выживаемости бактерий и концентрации микробных клеток штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена. Культуру данного штамма выращивали на мясо-пептонном бульоне в реакторе в течение 16 ч при температуре 370,5 С,- 7,20,3 С, скорости перемешивания - 120 об/мин, аэрации - 500 см 3 воздуха на 1 л среды в 1 мин. Концентрацию микробных клеток определяли с помощью стандарта мутности, а жизнеспособность (выживаемость) сальмонелл путем титрования и высева их на мясопептонный агар в чашках Петри. Результаты исследований показали, что выживаемость бактерий штаммаКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена - составила 100 , а концентрация микробных клеток - 32 млрд. м.т./см 3. Пример 3. Определение вирулентных свойств штамма бактерийКМИЭВ-В 124 штамма-антигена. Вирулентные свойства изучали в опытах на белых мышах живой массой 14-16 г и морских свинках живой массой 400 г, с этой целью готовили суспензию суточной агаровой культуры данного штамма в физиологическом растворе натрия хлорида. Животных заражали десятикратными разведениями подкожно в области спины в дозе 0,5 мл. За опытными животными вели наблюдение в течение 10 сут после заражения. На каждую заражающую дозу использовали по 10 животных. Расчет 50 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина, результаты исследований показали, что 50 штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена - составила для белых мышей 0,2104 м.к., а для морских свинок - 0,3108 м.к. Пример 4. Определение иммуногенной активности штамма бактерийКМИЭВВ 124 - штамма-антигена. Иммуногенную активность штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена - изучали на 20 белых мышах живой массой 16-18 г (10 иммунизированных - опытных и 10 контрольных). Через 15 дней после иммунизации всем опытным животным и контрольным инъецировали предварительно подтитрованную дозу 50 бактериальную культуры штаммаКМИЭВ-В 124 - штаммаантигена. Результаты реакции показали, что в опытной и контрольной группах все животные остались живы, клинических признаков заболевания не наблюдали. Следовательно,иммуногенная активность штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штаммаантигена - составляет 100 , в то время как в прототипе она равна 75 . 18101 1 2014.04.30 Пример 5. Определение антигенной активности штамма бактерийКМИЭВВ 124 - штамма-антигена. Антигенные свойства изучали в реакции непрямой гемагглютинации в разведении сыворотки до 1024. В качестве антигена использовали бактериальную культуру штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что антигенная активность штамма бактерийКМИЭВ-В 124 - штамма-антигена - составляет 7 2. Таким образом, штамм бактерийКМИЭВ-В 124 - штамм-антиген,выделенный от пушных зверей, - обладает высокой выживаемостью бактерий до 100(у прототипа штамма 72 ) и концентрацией микробных клеток 32 млрд м.т./см 3 (у прототипа штамма 23 млрд. м.т./см), высокой вирулентностью 50 для белых мышей 0,2104 м.к. и морских свинок 0,3108 м.к. (у прототипа штамма 50 для белых мышей 10 м.к., морских свинок - 1010 м.к.), более высокой иммуногенностью - 100(у прототипа штамма 75 ) и антигенной активностью 7 2 (у известного штамма 6 2), что является важным в процессе формирования иммунного ответа и создания биопрепаратов на основе заявленного штамма, поэтому он может использоваться в качестве штамма-антигена. Источники информации 1. Медведев А.П., Даровских С.В. Выживаемость сальмонелл при периодическом культивировании Ученые записки Витебск, гос. вет. акад. - Витебск, 2004. - Т. 40. - Ч. 1 С. 251-252. 2. Дремач Г.Е. Технология производства вакцин против сальмонеллеза телят и поросят Учебное пособие для студентов, аспирантов. - Витебск, 2003. - 21 с. (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4