Штамм бактерий Salmonella typhimurium КМИЭВ-В130 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Финогенов Артм Юрьевич Лемиш Артм Петрович Андрусевич Андрей Сергеевич Финогенова Елена Геннадьевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56) Технология производства вакцин против сальмонеллеза телят и поросят Учебно-методическое пособие для студентов, аспирантов по специальности Ветеринарная медицина и работников биопредприятий. - Витебск,2004. - С. 4-21.2216350 2, 2003.36864 , 2008.20239 , 2007. АМОСОВА Л.А. Современные технологии сельскохозяйственного производства. Материалы конференции.Международная научно-практическая конференция. - Т. 2. - Гродно, 2010. С. 153-154. МЕДВЕДЕВ А.П. и др. Ветеринарная наука - производству. Научные труды. Вып. 40. - Т. 2. - Минск, 2009-2010. С. 30-36. АМОСОВА Л.А. и др. Эпизоотология,иммунобиология, фармакология, санитария. - 2010. -2. - С. 54-57.(57) Штамм бактерийКМИЭВ-В 130 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к биотехнологии,и касается штамма, предназначенного для конструирования диагностических и лечебнопрофилактических биопрепаратов. Известен штамм, обладающий недостаточным накоплением бактериальной массы при выращивании на бульоне Хотттингера в реакторе, используемый для изготовлении биопрепаратов, обладающий наименьшим количеством балластных веществ. При этом накопление бактериальной массы данного штамма происходило интен 18100 1 2014.04.30 сивно до 10-12 ч культивирования и составило в этот период 41-42 млрд/см 3. Антигенная активность которого составляет - 8 2 1. Данный штамм обладает недостаточным накоплением бактериальной массы и низкой антигенной активностью для изготовления биопрепаратов в больших объемах. Известен штамм 3, исходные культуры которого обладают слабой патогенностью значение 50 которого для белых мышей составляет 107, а для морских свинок - 510 микробных клеток 2. На МПА штамм через 24 ч роста образует колонии -формы, на МПБ - через 10-12 ч вызывает равномерное помутнение среды, а на ППЖА через 24 ч - диффузный рост. Штамм при посеве на среды, содержащие углеводы и многоатомные спирты, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, манит, ксилозу, дульцит, арабинозу, не свертывает молоко, не разжижает желатин, образует сероводород, не образует индол. Недостатком данного штамма является возможность реверсии к первоначальным свойствам, то есть к ослаблению патогенности, что при изготовлении вакцин из такого штамма может привести к снижению иммуногенной активности, а следовательно, и защитных свойств. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма, обладающего высоким накоплением бактериальной массы при культивировании в реакторе на бульоне Хоттингера и высокими патогенностью и антигенной активностью для изготовления вакцины. Поставленная задача достигается тем, что штамм бактерийКМИЭВ-В 130 - штамм-антиген - выделен из селезенки норки трехмесячного возраста в 2009 г. в Молодечненском отделении Звероводство ЧУП Белкоопоптторг Белкоопсоюза Молодечненского района Минской области. Штамм бактерийКМИЭВ-В 130 - штамм-антиген - депонирован в коллекции микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского. Коллекционный номер КМИЭВ-В 130. Таксономическая принадлежность. Микроорганизм отнесен к виду, роду , семейству . Патогенность для животных. ШтаммКМИЭВ-В 130 - штаммантиген - патогенен для пушных зверей и лабораторных животных при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. Культурально-морфологические признаки. Данный микроорганизм в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, окрашенных по Граму, имеет вид мелких грамотрицательных палочек размером 0,7-1,52-5 мкм, располагающихся изолированно,реже парами, цепочками. Культура сальмонелл подвижная, спор и капсул не образует. Факультативный анаэроб. В МПБ, бульоне на основе перевара Хоттингера, в первый день выращивания дает легкое равномерное помутнение среды с образованием пленки и пристеночного кольца. На МПА, агаре на основе перевара Хоттингера, образует выпуклые прозрачные или белого цвета колонии диаметром 1,0-3,0 мм. На агаре Эндо растет в виде серовато-голубых прозрачных круглых колоний, на висьмут-сульфитном агаре - темнозеленых колоний с ровными краями. Биохимические свойства. Штамм бактерийКМИЭВ-В 130 штамм-антиген - обладает способностью ферментировать глюкозу, маннит, сорбит, арабинозу, инозит, мальтозу с образованием кислоты без газа, не ферментирует сахарозу,лактозу, раффинозу, дульцит, образует индол, сероводород, утилизирует цитраты, не продуцирует гемолизин и уреазу. Антигенный состав. Имеет в своем составе О-антигены 1, 4, (5), 12 и -антигены первой фазы - , второй фазы - 1, 2. 18100 1 2014.04.30 Другие особенности и маркерные свойства. Типизацию сальмонелл проводят согласно Наставлению по применению наборов сывороток сальмонеллезных -комплексных и монорецепторных - и -агглютинирующих. Условия хранения. Хранят в ампулах после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде при температуре (2)-( 4) С в течение 5 лет. Сохранность культуры обеспечивается путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера, МПА на основе перевара Хоттингера 1 раз в течение месяца. Антигенные свойства. Антигенная активность штамма бактерийКМИЭВ-В 130 - штамм-антиген - в РНГА составляет 9 2. Иммуногенность штамма бактерийКМИЭВ-В 130 - штаммантиген - составляет 95 . Вирулентность. Штамм бактерийКМИЭВ-В 130 - штаммантиген - обладает высокой вирулентностью, 50 которого составляет для белых мышей 0,23106 м.к., а для морских свинок - 0,5109 м.к. Устойчивость к антибиотикам. Штамм бактерийКМИЭВВ 130 - штамм-антиген - чувствителен к следующим антибактериальным препаратам энроксилу ( 5), левомицетину, канамицину, гентамицину, спектиномицину, флумеквину (флумизолу), окситетрациклину. Пример 1. Выделение штамма бактерийКМИЭВ-В 130 - штамм-антиген. Штамм бактерийКМИЭВ-В 130 - штамм-антиген - выделяли путем посева кусочков патологически измененной селезенки пушных зверей, больных сальмонеллезом, на висьмут-сульфит агар. Чашки Петри оставляли в термостате при 37 С на 16-18 ч. Через указанное время отмечали появление темно-зеленых колоний с ровными краями и специфического запаха. Пример 2. Культивирование штамма бактерийКМИЭВ-В 130 - штаммантиген. Выращивание данного штамма осуществляли в реакторе на питательной среде бульон Хоттингера при 37 С в течение 24 ч. Контроль накопления пастерелл осуществляли фотометрическим методом. Результаты исследований отображены в таблице. Накопление пастерелл в зависимости от времени культивирования (млрд м.т./мл) Время культивирования, ч 10-12 24 Питательная среда Известный Известный КМИЭВ-В 130 КМИЭВ-В 130 штамм штамм Бульон Хоттингера 41-42 45-46 45 52 Таким образом, накопление штамма бактерийКМИЭВ-В 130 штамма-антигена - на бульоне Хоттингера при культивирования в реакторе составило через 10-12 ч 45-46 млрд м.т./мл, а через 24 ч - 52 млрд м.т./мл, по сравнению с прототипом,соответственно через 10-12 ч 41-42 млрд м.т./мл, а через 24 ч - 45 млрд м.т./мл. Пример 3. Определение вирулентных свойств штамма бактерийКМИЭВВ 130 - штамм-антиген. Вирулентные свойства изучали в опытах на белых мышах живой массой 14-16 г и морских свинках живой массой 300-500 г, с этой целью готовили суспензию суточной агаровой культуры данного штамма в физиологическом растворе натрия хлорида. Животных заражали десятикратными разведениями подкожно в области спины в дозе 0,5 мл. За опытными животными вели наблюдение в течение 10 сут после заражения. На каждую заражающую дозу использовали по 10 животных. Расчет 50 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина, результаты исследований показали, что 50 3 18100 1 2014.04.30 штаммаКМИЭВ-В 130 - штамма-антигена - составила для белых мышей 0,23106 м.к., а для морских свинок - 0,5109 м.к. Пример 4. Определения антигенной активности штамма бактерийКМИЭВВ 130 - штамм-антиген. Антигенные свойства изучали в реакции непрямой гемагглютинации в разведении сыворотки до 1024. В качестве антигена использовали бактериальную культуру штамма бактерийКМИЭВ-В 130 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что антигенная активность штаммаКМИЭВ-В 130 - штамма-антигена - составляет 9 2. Таким образом, штамм бактерийКМИЭВ-В 130 - штаммантиген - обладает накоплением бактериальной массы для изготовления вакцины в объеме 52 млрд м.т./мл, что в 1,15 раз больше по сравнению с прототипом, обладающего способностью сохранять длительно высокую вирулентность 50 для белых мышей - 0,23106 м.к.,морских свинок - 0,5109 м.к. (у прототипа для белых мышей 107, морских свинок 1010),и более высокой антигенной активностью 9 2 (у прототипа 8 2) и может быть использован для конструирования профилактических и диагностических препаратов в качестве штамма-антигена. Источники информации 1. Кириллова В.В. Селекционные штаммы сальмонелл для изготовления инактивированных вакцин против сальмонеллеза животных Автореф. дис.канд. вет. наук. - М.,1988. - 25 с. 2. Дремач Г.Е. Технология производства вакцин против сальмонеллеза телят и поросят Учебное пособие для студентов, аспирантов. - Витебск. - 2003. - 21 с. (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4