Тест-система для выявления дифтерийного токсина в пробе

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА В ПРОБЕ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Колодкина Валентина Леонидовна Денисевич Татьяна Николаевна Титов Леонид Петрович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(57) Тест-система для выявления дифтерийного токсина в пробе, содержащая раствор биоконъюгата лошадиных антитоксических антител с коллоидным золотом и полоску нитроцеллюлозной мембраны, имеющую две зоны на первой фиксированы моноклональные мышиные антитела к фрагменту А дифтерийного токсина, на второй - антилошадиные антитела. Фиг. 1 Изобретение относится к микробиологии и медицинской диагностике и может быть использовано для выявления дифтерийной инфекции. Определение дифтерийного токсина является основным в диагностике дифтерийной инфекции. Многие методы его определения основаны на взаимодействии с антитоксиче 15675 1 2012.04.30 скими антителами с последующей визуализацией образовавшегося комплекса. В качестве меток используются ферменты (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза) и коллоидное золото. При использовании ферментных меток возникает необходимость в применении дополнительных реагентов и оборудования. Применение коллоидного золота обеспечивает непосредственную визуализацию результатов. Известна иммунохроматографическая тест-система для выявления дифтерийного токсина 1, включающая полоски нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ), разделенные на тестовую и контрольную зоны, с нанесенными на них антителами и зону связывания,содержащую биоконъюгат антитоксических антител с коллоидным золотом. В основе работы тест-системы лежит взаимодействие токсина с конъюгированными коллоидным золотом моноклональными мышиными антитоксическими антителами, миграция образовавшегося комплекса по мембране и фиксация его на поликлональных лошадиных антитоксических антителах тестовой зоны полоски. Тест-система позволяет определять токсин в концентрации 0,5 нг/мл через 3 часа от начала исследования, является простой и не требующей дополнительного оборудования. Однако тест-система является дорогостоящей из-за использования моноклональных антител в качестве детектирующих, кроме того, производители не раскрывают подробности производства ее компонентов. Задачей изобретения является разработка отечественной тест-системы определения дифтерийного токсина, не уступающей по специфичности и чувствительности известной. Технический результат достигается в тест-системе для выявления дифтерийного токсина в пробе, содержащей раствор биоконъюгата лошадиных антитоксических антител с коллоидным золотом и полоску нитроцеллюлозной мембраны, имеющую две зоны на первой фиксированы моноклональные мышиные антитела к фрагменту А дифтерийного токсина, на второй - антилошадиные антитела. Предлагаемая тест-система для выявления дифтерийного токсина включает высокоспецифичные моноклональные мышиные антитела к фрагменту А дифтерийного токсина,фиксированные на НЦМ, которые при взаимодействии с токсином, вырабатываемым коринебактериями в процессе роста на жидкой питательной среде, образуют комплекс, выявляемый при выдерживании в растворе биоконъюгата поликлональных лошадиных антитоксических антител (детекторные антитела) с коллоидным золотом. Тест-систему получают следующим образом. На тестовую зону нитроцеллюлозной мембраны наносится 1 мкл моноклональных мышиных антител к фрагменту А дифтерийного токсина в концентрации 1 мкг/мл. Моноклональные антитела имеют преимущества перед поликлональными, проявляющиеся в отсутствии перекрестной реактивности. Для контроля работоспособности тест-системы используют антилошадиные антитела(концентрация 2 мкг/мл), наносимые в количестве 1 мкл на контрольную зону НЦМ. Контрольные антитела должны реагировать с лошадиными антителами, конъюгированными с коллоидным золотом, вне зависимости от результата теста. Окрашивание в контрольной зоне свидетельствует об адекватной работе биоконъюгата. Для приготовления биоконъюгатаколлоидного золота доводят до 8,2, добавив к 5 мл раствора 25 мкл 0,2 М 23. К полученному раствору коллоидного золота добавляют 125 мкл антител (концентрация 1 мг/мл) и перемешивают на магнитной мешалке 20 мин, добавляют 100 мкл 1 -ного раствора ПЭГ М-20. Стабилизированный конъюгат центрифугируют при 14000 об/мин 10 мин на микроцентрифуге. После центрифугирования надосадок сливают и осадок ресуспендируют в 1 мл буфера для биоконъюгата. В качестве положительного контроля используется среда Иглас добавлением эмбриональной сыворотки КРС (20 ) и дифтерийного анатоксина (6 нг/мкл). В качестве отрицательного контроля используется среда Иглас добавлением эмбриональной сыворотки КРС (20 ). Пакетики из парафилма служат для размещения полоски при проведении реакции детектирования биоконъюгатом. 2 15675 1 2012.04.30 Тест-система работает следующим образом. Полоску НЦМ помещают в пробирку с суспензией исследуемых коринебактерий и инкубируют при 37 С в течение 5 часов с периодическим помешиванием. В процессе инкубирования вырабатываемый микробами токсин соединяется с мышиными антитоксическими антителами, образуя комплекс антиген-антитело. После инкубации НЦМ извлекают из суспензии, промывают прилагающимся буферным раствором и сушат. Смешивают в лунках планшета для серологических реакций 15 мкл золотистого красителя и 60 мкл раствора фосфатно-солевого буфера,8,2, вкладывают просушенные полоски нитроцеллюлозной мембраны в пакетики из парафилма, добавляют разведенный краситель. Пакетики запечатывают и инкубируют 30-60 минут. Поликлональные антитоксические антитела, конъюгированные с коллоидным золотом, будут реагировать с токсином, связанным с фиксированными на мембране моноклональными мышиными антителами, в результате чего полученный комплекс окрашивается в розовый цвет. При отсутствии токсина образование комплекса не происходит, окрашивания нет. На фиг. 1 представлена схема работы тест-системы при наличии токсина в пробе, где 1 - тест-зона НЦМ 2 - контрольная зона НЦМ 3 - моноклональные мышиные антитоксические антитела 4 - токсин 5 - поликлональные лошадиные антитоксические антитела, конъюгированные с коллоидным золотом (КЗ) 6 - антивидовые лошадиные антитела. На фиг. 2 представлена схема работы тест-системы при отсутствии токсина в пробе, где 1 - тест-зона НЦМ 2 - контрольная зона НЦМ 3 - моноклональные мышиные антитоксические антитела 5 - поликлональные лошадиные антитоксические антитела, конъюгированные с коллоидным золотом (КЗ) 6 - антивидовые лошадиные антитела. Учет результатов реакции проводят визуально. Появление двух пятен розового цвета на полоске (в тест- и контрольной зонах) интерпретируется как положительный результат. На фиг. 3 представлена полоска НЦМ при положительном результате теста. Появление одного пятна розового или красного цвета в контрольной зоне интерпретируется как отрицательный результат. На фиг. 4 представлена полоска НЦМ при отрицательном результате теста. Отсутствие пятен в контрольной зоне либо их наличие только в тест-зоне свидетельствует о неправильной постановке реакции или неисправности тест-системы. На фиг. 5 и 6 представлены полоски НЦМ при неадекватной работе тест-системы. Тест-система считается специфически активной при наличии выраженной реакции с положительным контрольным раствором и отсутствием реакции с отрицательным контрольным раствором. Заявляемая тест-система была испытана на 140 штаммах, в том числе 80 токсигенных. Чувствительность заявляемой тест-системы составляет 100(95 доверительный интервал, 98,0100), специфичность 100(95 доверительный интервал, 97,5100). Источники информации 1. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - Том 3. -2. С. 156-162. 3 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4