Способ выявления гистаминергических нейронов мозга

(51)01 33/48 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГИСТАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ МОЗГА(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(72) Авторы Зиматкин Сергей Михайлович Кузнецова Вера Борисовна(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(57) Способ выявления гистаминергических нейронов мозга, отличающийся тем, что выявляют моноаминооксидазу Б, которую используют в качестве маркера гистаминергических нейронов. Фиг. 1 Изобретение относится к области биологии, а именно к нейробиологии, нейрогистологии, и может использоваться для морфофункциональной оценки гистаминергических нейронов мозга. Известен способ выявления гистаминергических нейронов с использованием антител против гистамина, авидин-биотинового комплекса и пероксидазы хрена. ( ., ,. -., . . . 9178 1 2007.04.30 Недостатками способа являются 1) сложность, многоэтапность, длительность - 2-4 суток, трудоемкость 2) ненадежность, плохая воспроизводимость. Наиболее близким к предлагаемому является иммунофлюоресцентный способ выявления гистаминергических нейронов с использованием антител против гистамина и флюоресцентной метки ( .,,. ., . . . . . . ., 1984, . 81, . 2572-2576). Он включает перфузию крысы 2 раствором 1-этил-3-(3-диметил-аминопропил)-карбодимид ,постфиксация 2-4 ч (возможно в течение ночи) в 4. Пропитывание в 20 растворе сахарозы. Быстрое замораживание (в жидком азоте, приготовление срезов толщиной 20 мкм, расправление их на стеклах, покрытых желатином. Приготовленные срезы хранят при- 20 С. Промывание в фосфатном буфере 0,01 М 7,4 210 мин. Обработка первичными антителами НА 19 С (разведение 11000 или 12000 в фосфатном буфере 0,01 М 7,4(нормальная свиная сыворотка) (1100). Инкубация с вторичными антителами, связанными с(разведение 140 в фосфатном буфере 0,01 М 7,4) в темном месте. Промывание в фосфатном буфере 0,01 М 7,4 в течение 20 мин в темном месте. Заключение в -глицерол (11). Хранение в холодильнике (4 С) в течение 13 суток. Недостатком способа является сложность, трудоемкость, малый срок хранения препаратов, дороговизна и недоступность реактивов, необходимость специальной фиксации тканей. Задача изобретения - упрощение, повышение надежности и экономичности способа выявления гистаминергических нейронов. Поставленная задача решается путем выявления моноаминооксидазы Б, которую используют в качестве маркера гистаминергических нейронов. Способ осуществляют следующим образом. После декапитации крысы проводят вскрытие черепной коробки, извлечение головного мозга с последующим выделением гипоталамуса. Образец мозга, предварительно выдержав в парах азота, замораживают путем погружения в жидкий азот. Изготавливают криостатные срезы толщиной 20 . Срезы монтируют на предметные стекла, быстро расправляют и размораживают, а затем подсушивают при комнатной температуре в течение 3-4 часов. Срезы преинкубируют в течение 30 мин в фосфатном буфере 0,05 М 7,6 с хлоргилином 10-7 и окрашивают на выявление активности моноаминооксидазы типа Б(МАО Б), которая является маркером гистаминергических нейронов (Зиматкин С.М., Цыдик В.Ф. Гистохимический метод исследования активности моноаминооксидазы А и В в мозге. Морфология, 1994,4-6, с. 157-161). Инкубация в растворе диаминобензидина гидрохлорида (0,08 мг)пероксидазы хрена (1 мг)никель-аммонийного сульфата(6 мг)азида натрия (0,65 мг)тирамина гидрохлорида 1 мл Трис- буфера 0,05 М 7,6. Инкубируют в течение 2-х часов во влажной камере при температуре 37 С. Реакцию прекращают промыванием срезов в Трис- буфере с последующим обезвоживанием в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле и заключают в полистирол. В полученных гистохимических препаратах гипоталамуса избирательно и четко выявляются гистаминергические нейроны. Для иллюстрации полученных результатов прилагаются микрофотографии соседних срезов заднего отдела гипоталамуса крысы на уровне Р- 3,60, один из которых окрашен иммунофлюоресцентным способом с использованием антител против гистамина, а второй - на выявление активности МАО Б (фиг. 1, 2). Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом простота и быстрота изготовления препаратов (всего один инкубационный раствор,срок инкубации 2 часа) 9178 1 2007.04.30 надежность, хорошая воспроизводимость (по сравнению с прототипами), а по сравнению с иммунофлюоресцентным методом, гораздо большая длительность хранения готовых препаратов экономичность и доступность (в предлагаемом способе используются более дешевые и доступные реактивы). Способ прост, надежен, экономичен. Может быть использован в любой гистологической лаборатории. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3