Способ определения протеолитической активности
- или
- субъединицы фактора роста нервов

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(56) НИКАНДРОВ В.Н. и др. Труды Всероссийской конференции. Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия. - М. - 2002. С. 163-164.1246008 А 1, 1986.37647 С 2, 2004.1047 1, 1996.(57) Способ определения протеолитической активности - или -субъединицы фактора роста нервов, отличающийся тем, что исследуемую субъединицу фактора роста нервов добавляют к протамин-сульфату в концентрации 1-2 , инкубируют при температуре 37 С в течение 2-24 часов и проводят определение протеолитической активности по доле расщепленного белка. Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к оценке ферментативной активности субъединиц фактора роста нервов. Известен способ определения протеолитической активности субъединиц фактора роста нервов для общебиологических исследований, а также для прикладных целей для оценки их качества, создания (или изыскания) прежде всего специфических эффекторов ингибиторов и активаторов, миметиков фактора роста нервов, заключающийся в том, что очищенные образцы - и -субъединиц фактора роста нервов добавляют к содержащей плазминоген фибриновой пластине, инкубируют ее в термостате при 37 С в течение 2-24 ч и учитывают протеолитическую активность по степени расщепления белка субстрата, в данном случае измеряют площадь зон лизиса фибрина, обусловленного действием на субстрат активного протеолитического фермента плазмина, образовавшегося под действием - и -субъединиц фактора роста нервов из содержащегося в фибрине плазминогена 1. Указанный способ является прототипом в отношении заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является добавление исследуемых образцов - и -субъединиц фактора роста нервов к белковому субстрату, инкубация при температуре 37 С и определение меры расщепления белкового субстрата. Однако недостатком прототипа является непрямое, опосредованное через активацию плазминоге 11953 1 2009.06.30 на определение протеолитической активности. Именно плазмин, а не - и -субъединицы фактора роста нервов расщепляют фибрин. Из источников научно-технической литературы известно, что - и -субъединицы фактора роста нервов, а также олигомерная форма фактора роста нервов не способны расщеплять белковые субстраты, которые обычно используют для определения протеолитической активности фибрин, казеин, гемоглобин 2. Задачей заявляемого способа является повышение точности и специфичности оценки протеолитической активности - и -субъединиц фактора роста нервов. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ определения протеолитической активности - или -субъединиц фактора роста нервов, когда исследуемую субъединицу фактора роста нервов добавляют к протамин-сульфату в концентрации 1-2 , инкубируют при температуре 37 С в течение 2-24 ч и проводят определение протеолитической активности по доле расщепленного белка. Использование в качестве белкового субстрата протамин-сульфата позволяет оценить собственную, т.е. прямую протеолитическую активность - и -субъединиц фактора роста нервов, так как протамин-сульфат расщепляется этими субъединицами непосредственно без участия образованного из плазминогена плазмина. Пример 1. Определение активности в пробирке. В две пробирки, опытную и контрольную, вносят по 1,0 мл 1 -ного раствора протамин-сульфата в 0,06 М фосфатном буфере рН 7,4. В опытную пробирку добавляют 0,1 мл раствора (1,28 мг/мл) - субъединицы фактора роста нервов в этом же буфере. Обе пробирки инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Затем в обе пробирки вносят по 2,0 мл 2 н раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную - дополнительно 0,1 мл - субъединицы фактора роста нервов. Пробирки выдерживают в течение 20 мин при 4 С и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Супернатанты сливают, а осадки растворяют в аликтвотах по 0,5 мл 0,06 фосфатного буфера 7,4. Отбирают по 50 мкл полученных растворов осадков и определяют содержание белка по Бредфорд 3. Содержание белка в опытной пробе соответствует 0,17 мг/мл, а в контрольной пробе 1,65 мг/мл. Следовательно за 60 мин при температуре 37 С и рН 7,4 0,128 мг - субъединицы фактора роста нервов расщепляет 1,48 мг протамин-сульфата. Пример 2. Определение активности в тонком слое. На пластину 1 -ого агара , приготовленную на 0,06 М фосфатном буфере рН 7,4 и содержащую протамин-сульфат в концентрации 2 наносят по 15 мкл микродозатором 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4 (контроль) и растворы -субъединицы фактора роста нервов при концентрации 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл. Затем инкубируют белок-агаровую пластину с нанесенными на поверхность образцами при 37 С в течение 24 ч. Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют площадь зон расщепления белкового субстрата. Эта площадь у контроля (фосфатного буфера) равна 0 мм 2, она соответствует 192 мм 2 при концентрации субъединицы 0,5 мг/мл и 105 мм 2 при концентрации исследуемой субъединицы 0,25 мг/мл. Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет определить прямую протеолитическую активность - и -субъединиц фактора роста нервов, исключив промежуточную реакцию превращения плазминогена в активную протеиназу - плазмин, использовать стандартный белок субстрат, промышленное получение которого налажено целым рядом фирм. Этот протамин-сульфат дольше хранится без изменения свойств и более стандартен. Данный способ может найти широкое применение при создании (изыскании) специфических эффекторов фактора роста нервов и его миметиков. 2 11953 1 2009.06.30 Источники информации 1. Никандров В.Н., Пыжова Н.С. Энзиматические свойства фактора роста нервов и его субъединиц//В кн. Труды Всероссийской конфер. Проблемы медицинск. энзимологии,Соврем. Технологии лаборат. диагностики нового столетия, Международ. Сим-поз.,Пиридоксальфосфатзависимые ферменты структура, молекулярная патология и медицина. - М., 2002. - С. 163-164 (прототип). 2., -7//. - 1981. - . 80. - . 618. 3.// . . - 1976. - . 72. . 248-254. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3