Способ количественного определения фолатов

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОЛАТОВ(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси Учреждение образования Международный государственный экологический университет имени А.Д.Сахарова(72) Авторы Воробей Александр Васильевич Воробей Павел Александрович Пинчук Сергей Владимирович(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси Учреждение образования Международный государственный экологический университет имени А.Д.Сахарова, 1997. - . 351. - . 223-228. ВОРОБЕЙ П.А. и др. Материалы международного симпозиума Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии, часть 1, Гродно, 2006, - С. 39-43. Экспериментальная витаминология, 2006. - . 82. - . 817-822. ТЕЛЕГИНА Т.А. и др. Прикладная биохимия и микробиология, 2005. - Т. 41.3. - С. 315-323. КРИЦКИЙ М.С. и др. Доклады Академии наук, 2001. - Т. 380. -3. С. 408-410. ВОРОБЕЙ П.А. и др. Материалы международной конференции Медико-биологические аспекты действия физических факторов, Минск, Бизнесофсет,2006. - С. 64-66.20050254, 2006.(57) Способ количественного определения фолатов, включающий фоторазрушение фолатов в анализируемой пробе, измерение интенсивности флуоресценции образующихся фотопродуктов и определение концентрации фолатов по калибровочному графику зависимости интенсивности флуоресценции фотопродуктов от концентрации фолатов в пробе, отличающийся тем, что для фоторазрушения фолатов используют фотосенсибилизируемое воздействие. Изобретение относится к химической, биологической и пищевой технологиям, медицине и ветеринарии, в частности к количественному определению фолатов, и может быть использовано для экспрессного количественного определения фолатов в растворах, культуральных средах, продуктах питания и биологических жидкостях. Фолаты являются водорастворимыми витаминами. Для контроля их содержания в организме человека и животных, в продуктах питания, а также в ряде технологических процессов требуются высокочувствительные экспрессные способы количественного определения 13409 1 2010.08.30 различных форм фолатов, включая используемую в качестве витаминной добавки синтетическую форму - фолиевую кислоту (ФК). Известен способ количественного определения фолатов путем выращивания микроорганизмов, требующих для своего роста фолаты, на содержащей анализируемую пробу среде с последующим определением скорости роста микроорганизмов 1. Однако этот способ характеризуется длительным временем проведения анализа и низкой точностью. Известен способ количественного определения фолатов путем их связывания антителами 2 или фолат-связывающими белками 3 с последующим определением числа связавшихся молекул (радиоиммунологический анализ, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммунохемилюминесцентный анализ и анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса). Однако различная специфичность антител и фолатсвязывающих белков к разным формам фолатов затрудняет применение этого способа для определения общего содержания нескольких форм фолатов, присутствующих в анализируемой пробе. Известен способ количественного определения фолатов путем фотометрии или флуориметрии фолатов или продуктов их взаимодействия со специфическими химическими реагентами 4, в том числе после хроматографического разделения различных форм фолатов в анализируемой пробе 5. Однако этот способ характеризуется низкой чувствительностью. Наиболее близким, принятым за прототип, является фотохимический способ количественного определения фолатов путем их разрушения при поглощении ими УФ-излучения с последующей флуориметрией образующихся фотопродуктов 6. Данный способ имеет ряд недостатков в пробах с концентрацией фолатов менее 0,5 мг/л и/или содержащих белки, ароматические аминокислоты, антиоксиданты и ряд других соединений скорость фоторазрушения фолатов является весьма низкой, что ведет к значительному увеличению времени проведения анализа и/или снижению чувствительности. Нелинейная зависимость количества образуемых фотопродуктов от дозы облучения снижает точность анализа. Использование для разрушения фолатов УФ-излучения затрудняет анализ биологических проб, как правило, содержащих поглощающие УФ-излучение соединения. В связи со значительными различиями в спектрах поглощения различных форм фолатов для их фоторазрушения необходимо использовать УФ-излучение с различной длиной волны, что усложняет систему для облучения и ограничивает возможность анализа проб, содержащих различные формы фолатов. Задачей изобретения является повышение чувствительности, сокращение времени проведения анализа, увеличение точности и обеспечение возможности проведения анализа проб, содержащих различные формы фолатов, в том числе в присутствии других биологических молекул. Поставленная задача в способе количественного определения фолатов достигается путем их фоторазрушения в анализируемой пробе, измерения интенсивности флуоресценции образующихся фотопродуктов и определения концентрации фолатов по калибровочному графику зависимости интенсивности флуоресценции фотопродуктов от концентрации фолатов в пробе. Согласно изобретению, для фоторазрушения фолатов используют фотосенсибилизируемое воздействие. Отличительным признаком изобретения является использование фотосенсибилизируемого воздействия для фоторазрушения фолатов. Для чего в анализируемую пробу вводят краситель-фотосенсибилизатор, поглощающий излучение в видимой области спектра и сенсибилизирующий фоторазрушение фолатов с образованием флуоресцирующих фотопродуктов. По интенсивности флуоресценции фотопродуктов определяют концентрацию фолатов в пробе. Такое определение возможно вследствие того, что фотосенсибилизируемое воздействие вызывает разрыв связи 9-10 в молекулах различных форм фолатов с образованием флуоресцирующих фотопродуктов, в частности птеринов 7, имеющих высокий квантовый выход флуоресценции. 2 13409 1 2010.08.30 Использование фотосенсибилизируемого воздействия для разрушения фолатов с образованием флуоресцирующих фотопродуктов позволяет значительно сократить время проведения анализа и увеличить чувствительность способа, что дает возможность определять содержание фолатов в пробах с низкой их концентрацией, содержащих белки, ароматические аминокислоты, антиоксиданты и другие соединения, т.к. скорость фотосенсибилизированного разрушения фолатов в таких пробах значительно выше, чем скорость фоторазрушения при поглощении ими УФ-излучения повысить точность анализа, поскольку количество образуемых фотопродуктов линейно зависит от дозы облучения обеспечить возможность анализа проб, содержащих поглощающие УФ-излучение соединения упростить систему для облучения и увеличить точность определения суммарного содержания фолатов в пробах, содержащих различные их формы. Способ осуществляют следующим образом к анализируемой пробе добавляют краситель-фотосенсибилизатор, способный при поглощении излучения в видимой области спектра генерировать радикалы и активные формы кислорода, вызывающие разрушение молекул фолатов. Образцы освещают поглощаемым фотосенсибилизатором светом, после чего измеряют интенсивность флуоресценции образовавшихся в них продуктов фотосенсибилизированного разрушения фолатов. По калибровочному графику определяют концентрацию фолатов в пробе. Построение калибровочного графика осуществляют путем измерения интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения фолатов в пробах с известным составом и концентрацией фолатов. На фиг. 1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК при возб.350 нм и рег.445 нм от концентрации ФК в культуральной среде -1640 ( 1145) после освещения в течение 3 мин в присутствии фотосенсибилизатора 5,10,15,20-мезо-тетра(4 метил-пиридил)порфина (ТМРуР) в концентрации 2 мкМ. Растворы, содержащие ФК, разводили в 20 раз в дистиллированной воде, вводили ТМРуР, помещали в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см и освещали поглощаемым ТМРуР видимым светом люминесцентных ламп 40/03 (плотность мощности - 110 Вт/м 2). На фиг. 2 представлена зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК при возб.350 нм и рег.445 нм от времени освещения водного раствора ФК (4,5 мг/л) в присутствии фотосенсибилизатора 5,10,15,20 тетрафенил-21 Н,23 Н-порфинтетрасульфоната (4) в концентрации 10 мкМ. Раствор помещали в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см и освещали поглощаемым 4 видимым светом галогеновой лампы(плотность мощности - 150 Вт/м 2). Фиг. 1 демонстрирует линейную зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК птериновой природы с характерными длинами волн возбуждения (350 нм) и флуоресценции (445 нм) от концентрации ФК в пробе в диапазоне 0,01-0,70 мг/л. Линейная зависимость от концентрации ФК наблюдается также и при регистрации интенсивности флуоресценции образуемых при фотосенсибилизированном разрушении ФКаминобензоилглутаматов в облученной пробе. Фиг. 2 демонстрирует линейную зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК от времени освещения пробы до 45 мин. Такая зависимость повышает точность и экспрессность получения результата по сравнению с экспоненциальной зависимостью при фоторазрушении ФК под действием УФ излучения 8. Достоинствами предлагаемого способа являются высокая чувствительность (до 0,01 мг/л по сравнению с 0,1 мг/л в прототипе) и короткое время проведения анализа (время освещения пробы не превышает 10 мин при возможности одновременного освещения большого количества проб). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4